大型真菌有显著的子实体形态,典型的如像担子菌中的灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）,其子实体形成后在很短时间内开伞自溶并且释放担孢子。这一过程最最有趣的现象之一是菌柄在很短时间内长度实现数十倍的增加。前期研究表明主要的生长部位在菌盖内的菌柄区域,这一生长方式类似于植物中胚芽鞘的生长,该过程中主要依赖于细胞的伸长生长。一方面,菌柄细胞的生长需要摆脱细胞壁的束缚,因而细胞壁需要维持足够的可塑性,这样新合成的细胞壁组分才能嵌入已有的细胞壁中以实现细胞壁的伸长;另一个方面,菌柄组织形态的完整性需要细胞壁提供足够的机械强度来维持,也就是说细胞壁还要有足够的刚性。因此,在灰盖鬼伞子实体菌柄伸长生长过程中菌柄细胞壁发生了显著的重构修饰。本实验室前期以27mm长的幼嫩灰盖鬼伞子实体为研究对象确定了菌柄伸长生长区域及菌柄不同区域细胞壁的伸长特性。本文为了研究伸长生长中灰盖鬼伞菌柄细胞壁的重构修饰,我们对菌柄各区域细胞壁微观结构以及分子结构组成进行了研究,此外,对可能参与该过程的一些重构酶进行了异源重组表达和鉴定以及相关生物功能的分析。为了获得差异明显的对比结构,本研究选取生长至60mm的灰盖鬼伞子实体为研究对象,将菌柄从顶部到基部划分为6个区域,取其中1-10 mm为顶端、20-30 mm为中部、40-50 mm为基部以及50-60 mm为基部膨大四个区。顶端和中部为伸长区,基部与基部膨大为非伸长区。通过场发射扫描电镜（FESEM）发现灰盖鬼伞在菌柄伸长区域与非伸长区域细胞壁外表面都附着有大量颗粒物,但是内表面仅非伸长区有颗粒物。热碱可以去除这些颗粒物,在非伸长区碱处理后其细胞壁内外面均有无定形物附着。用β-1,3-葡聚糖酶不仅能去除细胞壁表面的这些颗粒物与无定形物,还能除去除非伸长区细胞壁外表面以外的大部分细胞壁中包埋几丁质微丝的基质组分。在伸长区域细胞壁内表面几丁质微丝紧排列密且横向分布,非伸长基部区域细胞壁的微丝分布稀松甚至随机取向。我们认为细胞壁表面的球状颗粒物和无定形物质的沉积、微丝结构以及细胞壁基质的改变可能引起细胞壁可塑性的丧失最终导致菌柄伸长的停止。为了研究菌柄顶端与基部的细胞壁碱不溶葡聚糖的分子结构的组成,将其用内切β-1,3-葡聚糖酶酶解,用阴离子高效液相色谱结合质谱（HPAEC-MS）的方法对酶解产物的结构和连接方式进行分析。结果表明伸长区顶端菌柄其β-1,3-葡聚糖链有较少的β-1,6-分支点,而非伸长区基部则含有较多。β-1,4-连接在顶端和基部几乎没有差异。β-1,3-葡聚糖链中分支点的增加可能引起其与细胞壁基质组分交联程度的增加从而引起细胞壁伸长的停止。另外菌柄基部耐葡聚糖酶解的组分显著多于菌柄顶端,进一步证明了随着菌柄细胞壁的成熟,其β-1,3-葡聚糖与细胞壁基质的交联更加紧密,从而使细胞壁更加耐各种酶的酶解。本文进一步对可能参与菌柄伸长过程的相关细胞壁重构酶进行毕赤酵母真核异源重组表达。其中有修饰细胞壁中几丁质的几丁质酶（chitinases）和几丁质脱乙酰化酶（chitin deacetylases）,修饰β-1,3-葡聚糖的内切β-1,3-葡聚糖糖苷转移酶（endo-1,3-beta-glucanosyltransferases）。异源表达的几丁质酶ChiⅢ,经过对其酶学特性的研究,我们认为该酶是一个从未报道的新几丁质酶,ChiⅢ既具有内切活性又具有外切活性。当以三糖至五糖低聚度的几丁质寡糖为底物时,它具有外切活性,释放N-乙酰氨基葡萄糖单体;当以五糖以上聚合度的几丁质寡糖为底物时,它具有内切活性,释放不同长度的几丁质寡糖。之前qPCR定量分析表明该酶在灰盖鬼伞生长过程中显著表达,推测其可能参与菌柄伸长过程细胞壁的软化过程,在子实体自溶过程参与细胞壁几丁质组分的降解。内切几丁质酶ChiEn1经过酶学性质鉴定,其既有内切活性又具有外切活性,还具有转糖基活性。这三种活性随着底物聚合度的不同而相互转变,通过外切几丁质二糖酶活作用方式从（GlcNAc）3-5非还原端释放（G1cNAc）2;通过内切几丁质酶活性作用方式从（GlcNAc）6-8释放（GlcNAc）3,能从（GlcNAc）4-6转（GlcNAc）2-生成更大寡糖,后来再降解为（G1cNAc）3,但是（G1cNAc）3不能发生转糖基作用,（G1cNAc）3最终转化为（G1cNAc）2和GlcNAc。将（G1cNAc）8从其非还原端水解（GlcNAc）3,对于不溶性几丁质不能有效水解。我们认为ChiEn1不具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性或者外切单糖活性,通过三种内源性酶活协同的新水解机制转化可溶性几丁质寡糖生成GlcNAc。该基因在菌盖扩张自溶水解过程中表达量较高,在菌柄各个部分表达量都很低,但是这也吻合其酶学特性,在高浓度酶作用时其表现出强烈的水解特性,低浓度时其转糖基活性较强,能够延长几丁质链。推测在菌柄伸长时参与几丁质链的延长,在菌盖扩张自溶水解过程协同其他几丁质酶主要参与菌盖细胞壁几丁质的降解。几丁质能够被几丁质脱乙酰化酶脱去乙酰基生成壳聚糖。几丁质和壳聚糖的化学性质差别很大,我们推测几丁质脱乙酰化酶可能参与改变菌柄成熟过程中细胞壁物理化学特性的重构修饰作用。我们重组表达了灰盖鬼伞几丁质脱乙酰化酶Cdal,我们首次通过结合脉冲电压安培检测器的阴离子高效液相色谱方法以（GlcNAc）n（n=1-6）为底物对其活性进行了分析,发现该酶能将几丁质二糖至六糖脱乙酰生成部分脱乙酰的几丁质寡糖,不能脱去N-乙酰氨基葡萄糖的乙酰基。通过荧光定量PCR分析发现,cdal随着菌柄的成熟其表达量增高,推测Cdal可能参与细胞壁的成熟过程中几丁质的重构修饰。内切β-1,3-葡聚糖糖基转移酶能够从β-1,3-葡聚寡糖链的内部切割,将生成的含有非还原端的寡糖酶复合体转移至已有β-1,3-葡聚寡糖非还原端上生成更长链的β-1,3-葡聚寡糖,从而使得较短的β-1,3-葡聚糖链延伸。在灰盖鬼中,两个内切β-1,3葡聚糖糖苷转移酶Glt1和Glt2,序列高度同源,蛋白分子量大小相近,活性相同,是严格的βH依赖性酶,仅在酸性条件下有活性。以昆布六糖为底物均能产生聚合度在2-23的昆布寡糖,对于聚合度四及更小寡糖没有转糖基活性。通过荧光定量PCR分析发现,rglt1和rglt2在菌柄顶部有较高表达量,推测内切β-1,3-葡聚糖糖基转移酶可能参与菌柄伸长过程中的葡聚糖链的延伸。