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植物病毒病害是农作物生产中的重要病害,给农业生产造成巨大的损失。马铃薯 Y病毒(PVY)对马铃薯、烟草等重要经济作物危害十分严重,其侵染所造成的损失可达80%,尤其是马铃薯 Y 病毒坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝收。马铃薯X 病毒(PVX)单独侵染可使马铃薯产量损失 10%~20%,但是 PVX 在田间常常与其它病毒混合侵染,特别是马铃薯 Y 病毒与之混合侵染引起的病毒协生作用,在生产中造成的损失更为严重。RNA 介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点,但也存在抗病谱窄的缺点。本实验室转化非翻译马铃薯 Y 病毒坏死株系的衣壳蛋白基因(PVYN-MCP)或者该基因不同长度的基因片段,均获得高度抗病的转基因植株,且证明这种抗病性为 RNA 介导的抗病性。此外,本实验室将马铃薯 Y病毒坏死株系的部分衣壳蛋白基因 3′ 端和 5′ 端 200bp 的基因片段设计成反向重复(IR)和正向重复(DR)序列,都获得不同比例的抗病转基因植株,但反向重复转基因获得抗性转基因植株比例高于转正向重复的转基因植株。 基于生产中存在的问题和本实验室的研究基础,本研究将非翻译马铃薯 X 病毒的衣壳蛋白基因(PVX-CP)和非翻译马铃薯 Y 病毒的衣壳蛋白基因(PVYN-CP)不同长度以不同顺序组成嵌合基因,构建植物表达载体;另外用 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 3′ 端200bp 的基因片段以不同的连接顺序构建了基于 pFGC5941(dsRNA 植物表达载体)和pROKII 设计的 Hairpin 结构植物表达载体,转化烟草,以探索利用这一策略培育多抗病毒转基因植株的可行性,并寻找赋予 RNA 介导抗性的最短有效片段的长度,从而为今后进行植物多抗病毒育种奠定基础。研究结果和主要结论如下:1.非翻译 PVYN-CP 和 PVX-CP 以不同长度和顺序组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究1.1根据本实验室已克隆的PVYN-CP的全长cDNA序列(804bp)和PVX-CP的全长cDNA序列设计了非翻译全长及 3′ 端部分基因片段的特异引物,以 PVX-CP 和 PVYN-CP 的cDNA 为模板,进行 PCR 扩增,得到相应的基因扩增产物,PCR 产物纯化后进行单酶切,用 T4 DNA 连接酶把相应的基因片段进行体外连接,双酶切纯化后,与用相同酶处理的克隆载体 pUC19 连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α,筛选并获得重组克隆质粒pUCXY、pUCfXY、pUCYX 和 pUCfYX。序列测定表明,已成功克隆出嵌合基因 XY、 1<WP=14>利用 RNA 介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株fXY、YX 和 fYX。构建植物表达载体 pROKXY、pROKYX、pROKfXY 和 pROKfYX。1.2 将成功构建的植物表达载体利用冻融法直接导入农杆菌 LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和 PCR 检测,结果表明,转化 pROKXY、pROKYX、pROKfXY 和 pROKfYX 分别获得 338、275、454、589 株 T0 代转基因植株。1.3 转基因植株的抗病性分析表明,只有转化 pROKXY 的转基因植株中出现 6 株对两种病毒的抗性都达到免疫的植株。转 pROKYX、pROKfXY 和 pROKfYX 的 T0代转基因植株中没有抗病表现型出现。1.4 为了分析转基因的拷贝数与抗病性的关系,对转化 pROKXY 获得的抗病转基因植株和部分感病转基因植株进行 Southern blot 分析,结果表明,抗病植株的转基因多数为多拷贝(5～6 个拷贝),而感病植株的转基因拷贝数明显偏低(1～3 个拷贝)。1.5 转基因植株的 Northern blot 分析表明,转基因都在 RNA 水平上得到了表达,不同抗病表现型的转基因植株之间在 RNA 积累量上存在差异,抗病植株的 RNA 积累量明显少于感病植株。这说明抗病性为 RNA 介导的抗病性,是 RNA 沉默的结果。2. PVYN-CP 3′ 端基因片段和 PVX-CP 3′ 端基因片段组成嵌合基因构建 Hairpin 结构基因转化烟草的抗病性研究2.1 带有内含子的 Hairpin 结构植物表达载体的构建 根据本实验室已克隆的 PVYN-CP 的全长 cDNA 序列(804bp)和 PVX-CP 的全长cDNA 序列以及双链植物表达载体 pFGC5941 引物设计要求,设计了两种病毒 CP 基因 3′端 200bp 基因片段的特异引物,以 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 cDNA 为模板,进行 PCR 扩增,得到 200bp 的基因扩增产物。将扩增产物单酶切后,按照预先设计的连接方式 用T4 DNA 连接酶于 16℃体外连接。从低熔点琼脂糖凝胶电泳中回收连接产物 X200Y200 和Y200X200,用相应的酶(BamHI 和 XbaI)进行双酶切,再与用相同酶处理的克隆载体 pUC19连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α。筛选并获得重组克隆质粒 pUCX200Y200 和pUCY200X200。对重组质粒进行序列测定,表明我们已经成功克隆出嵌合基因 X200Y200和Y200X200。先用NcoI和SwaI从重组质粒上切下嵌合基因,与用相同酶处理的pFGC5941进行连接,构建中间植物表达质粒 pFXY 和 pFYX,再用 XbaI 和 BamHI 从重组质粒上切下嵌合基因,与用相同酶处理的中间植物表达质粒 pFXY 和 pFYX 连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α。重组质粒用 NcoI 进行酶切鉴定,鉴定结果表明植物表达载体 pFXYiYX和 pFYXiXY 构建成功。2.2 Hairpin 结?