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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)因具有广泛的药理作用而被中医药市场大量需求,其主要药效成分为丹参酮和丹酚酸,这两类物质含量是丹参制剂的主要质量指标,所以如何提高丹参中这两类物质的含量是丹参研究的重点。磷是植物生长必须的营养元素,然而土壤中的磷元素易被固化,目前很多丹参种植区域面临可吸收磷资源贫乏的问题。低磷胁迫会引起植物代谢的改变,促进次生代谢物的积累,如果低磷可以促进丹参中药效成分的积累,将会是一个既节省资源又环保增产的策略。本研究中,我们首先探讨了不同程度的磷缺失对紫花丹参植株生长及代谢调控的影响,筛选出次生代谢积累的最适磷浓度,并以紫花丹参和绒毛鼠尾草毛状根为材料,研究两种鼠尾草属植物对低磷响应机制的异同。为了进一步研究次生代谢与低磷响应之间的关联,我们从丹参中克隆出两条响应低磷胁迫的R2R3-MYB转录因子:SmMYB98b和SmMYB9a,对它们的功能进行研究,发现这两个转录因子正调控丹参酮的积累,且参与了丹参对低磷的响应。此外我们还克隆得到两个低磷响应信号通路中的SPX基因:SmSPX2和SmSPX4,SmMYB9a与SmSPX2、SmSPX4都存在互作。具体研究结果如下:1.研究土壤中四个磷浓度:全磷(200 mg/kg)、轻度缺失(100 mg/kg)、重度缺失(10 mg/kg)及完全缺失(0 mg/kg)对紫花丹参植株生长发育及次生代谢指标的影响。与全磷相比,磷轻度及重度缺失情况下丹参植株中磷含量明显减少,根的生物量变化不明显;光合作用增强,多糖和花青素积累增加;GA含量降低,IAA含量升高。随着土壤中磷浓度的降低,丹参根中四种丹参酮的含量呈上升趋势,磷完全缺失情况下,丹参根中丹参酮I、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮IIA的含量分别为对照的7.31、4.5、7.55和1.97倍。2.以丹参(紫花丹参)和绒毛鼠尾草的毛状根为材料,进一步研究两种鼠尾草属植物对低磷胁迫响应机制的异同。结果显示,低磷促进了这两种鼠尾草毛状根中丹参酮的积累及丹参酮合成通路关键酶基因的表达,增强了丹参提取物的抗氧化活性。与紫花丹参相比,绒毛鼠尾草中有效磷含量较高,且能够更积极的对低磷胁迫做出响应,具体表现在次生代谢物的积累,合成通路酶基因的表达,抗氧化活性及SPX基因的表达。3.参照丹参转录组数据库,通过基因克隆得到开放阅读框为699 bp的R2R3-MYB转录因子SmMYB98b,SmMYB98b编码232个氨基酸,预测的蛋白分子量为27 KD,等电点7.58。系统进化分析发现SmMYB98b属于R2R3-MYB转录因子的第20亚家族,与拟南芥中参与低磷信号的AtMYB2和AtMYB62聚为一类。SmMYB98b蛋白定位于细胞核,为核定位的转录因子。通过遗传转化成功获得SmMYB98b过表达(OE-SmMYB98b)及沉默表达(RNAi-SmMYB98b)的转基因丹参毛状根。OE-SmMYB98b毛状根中磷浓度降低,磷响应基因被诱导。与野生型毛状根相比,OE-SmMYB98b毛状根中丹参酮含量升高了6-30倍,丹参酮合成通路关键酶基因的表达也被显著诱导。而RNAi-SmMYB98b毛状根中丹参酮含量降低,丹参酮合成通路关键酶基因的表达被强烈抑制。SmMYB98b对丹参酮的调控受磷水平影响,低磷胁迫缩小了OE-SmMYB98b毛状根与RNAi-SmMYB98b毛状根中丹参酮积累的差距。4.参照丹参转录组数据库,通过基因克隆得到开放阅读框为786 bp的R2R3-MYB转录因子SmMYB9a。SmMYB9a编码261个氨基酸,预测其分子量为29.8 KD,等电点为6.4。SmMYB9a在细胞质和细胞核中均有分布且主要分布在细胞核中,原核表达分析发现SmMYB9a编码的蛋白大小与生物信息学预测的结果一致。系统进化分析发现SmMYB9a同样属于S20亚家族,低磷胁迫抑制了SmMYB9a的表达。通过遗传转化方法获得了SmMYB9a的过表达(OE-SmMYB9a)及沉默表达(RNAi-SmMYB9a)转基因丹参毛状根,与野生型相比,OE-SmMYB9a毛状根中丹参酮含量升高了8-35倍,丹酚酸含量降低;而RNAi-SmMYB9a转基因毛状根中丹参酮含量降低,丹酚酸含量升高了1.4-2.5倍。OE-SmMYB9a毛状根中磷浓度下降,低磷响应基因的表达被促进,而RNAi-SmMYB9a毛状根中磷含量升高,低磷响应基因的表达被抑制。5.克隆出两条响应低磷胁迫的SPX基因SmSPX2和SmSPX4,其开放阅读框分别为855 bp和882 bp。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术发现,SmMYB9a与SmSPX2、SmSPX4都存在互作。