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肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan-recognitionprotein,PGRP)作为一种模式识别受体(Pattern-recognition receptor,PRR),广泛存在于昆虫和高等动物中。它们可以识别细菌表面的肽聚糖(Peptidoglycan,PG),从而激活免疫信号传导或行使抑菌的功能。目前,关于PGRP的研究主要集中在果蝇和家蚕,而对其他鳞翅目昆虫PGRP的研究较少。有鉴于此,本文以鳞翅目夜蛾科的粘虫(Mythimnaseparata)为研究对象,克隆得到了一个表达短型PGRP(PGRP-S)蛋白的基因,将其命名为MsePGRP-S1,并对其免疫相关功能进行了研究。相关结果为进一步阐明肽聚糖识别蛋白在鳞翅目昆虫免疫防御系统中的作用,以及研究昆虫-病原互作机理奠定了基础。主要结果如下:1.序列分析:通过DNAMAN分析,MsePGRP-S1 cDNA包含一个长度为591bp的开放读码框(ORF),编码197个氨基酸。预测该蛋白具有一个信号肽序列(aa:1-18)和一个保守的PGRP结构域(aa:32-181)。蛋白的预测分子量为19719.7 Da,等电点为5.5。序列联配显示:MesPGRP-S1具有5个依赖Zn2+的酰胺酶活性位点(H-Y-H-T-C),并包含了 G-W-R位点。系统发育分析显示MsePGRP-S1与家蚕的PGRP-S3、S4、S5、S6和冈比亚按蚊PGRP-S2、S3的亲缘关系较近。2.基因的组织分布和诱导表达:通过RT-PCR实验检测MsePGRP-S1转录产物在粘虫幼虫的不同组织中的表达情况,结果显示其在血细胞、中肠、脂肪体和表皮中均有表达。通过Realtime PCR检测注射细菌后幼虫血细胞、中肠和脂肪体中MsePGRP-S1表达量的变化,结果显示:MsePGRP-S1的表达量会受到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激的调控。受细菌刺激后,不同组织中MsePGRP-S1的表达量在某些时间点有显著上调。3.重组蛋白与细菌和肽聚糖的结合:通过Western Blot检测MsePGRP-S1重组蛋白与细菌的结合,结果显示:其主要与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌结合。从金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中分离纯化得到肽聚糖,通过ELISA实验检测MsePGRP-S1重组蛋白与金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的肽聚糖的结合,结果显示它们有明显的结合,且随着MsePGRP-S1浓度的提高,结合增强。4.抑制细菌生长实验:通过CCK-8法检测MsePGRP-S1重组蛋白对细菌生长的抑制效应,结果显示:可以显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和粘质沙雷氏菌的生长。通过扫描电镜检测MsePGRP-S1重组蛋白对细菌形态的影响,结果显示:处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞严重破损。5.酰胺酶活性分析:通过Realtime PCR检测经MsePGRP-S1重组蛋白处理的肽聚糖刺激果蝇S2细胞后其抗菌肽基因表达量的变化,结果显示:经MsePGRP-S1重组蛋白处理过的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌肽聚糖失去了刺激果蝇S2细胞抗菌肽表达的活力。进一步检测酰胺酶活性分析显示:MsePGRP-S1重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的肽聚糖具有酰胺酶活性,在溶菌酶存在的情况下,MsePGRP-S1对金黄色葡萄球菌的酰胺酶活性进一步增加。综上所述,MsePGRP-S1的序列具有典型的短型PGRP的特征,其转录产物可以被细菌显著诱导,其重组蛋白具有免疫相关的功能:可以识别细菌和肽聚糖,对细菌的生长具有明显的抑制作用,具有酰胺酶活性,相关结果显示该蛋白在粘虫的先天免疫防御系统中发挥着重要作用。