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目的:
疟疾是由疟原虫引起的严重危害人类健康的重要传染性疾病之一。而作为疟疾的重要并发症，脑型疟疾（脑疟）是引起疟疾感染患者死亡的主要原因。目前仍然没有有效的措施可以控制脑型疟疾的发生与进展。当前学者们普遍认为机体过度的炎性反应与脑疟的发生密切相关。因此通过调控疟疾患者机体的炎性应答来防控脑疟一直是重要的研究方向。近年来众多的研究发现一些造血细胞生成因子除了具有促进血细胞生成的作用之外，还具有其他的非造血功能。如促红细胞生成素(EPO)可促进红细胞生成，还具有抗炎性反应等多种功能，并被证实能够抑制实验性脑型疟疾的发生。而作为最主要的促血小板生成因子，促血小板生成素(TPO)在分子结构上与EPO具有一定的同源性(23％)，且其受体c-Mpl也表达于某些免疫细胞，并可在一定程度上影响免疫细胞的功能。脑疟的发病机制及临床表现与脑栓塞具有一定共性，而近期有研究证实在大鼠的实验性缺血性脑栓塞模型中，重组人促血小板生成素(rhTPO)能通过降低MMP-9水平阻断抑制血脑屏障的破坏。由于炎性反应能够诱导MMP-9的产生，有理由推测TPO可能是通过降低炎性反应抑制血脑屏障的破坏。而rhTPO可能因此能够在脑疟中的发挥保护性作用。为此，本研究拟利用rhTPO处理感染后的小鼠脑疟模型，探讨rhTPO对小鼠实验性脑疟发生的影响及其免疫相关机制。
材料与方法:
1.实验动物模型构建与分组
6-8周龄，雌性C57BL/6小鼠（购买于北京动物研究所）随机分为3组，正常对照组（不予任何处理与干预），感染对照组，rhTPO处理感染组。感染对照组与rhTPO处理感染组小鼠经腹腔感染1×106 P.bANKA(PbA)寄生的红细胞(pRBC)，构建脑疟模型。rhTPO处理感染组于感染后第一天经尾静脉注射一次rhTPO(4μg/kg)。实验期间动态观察生存率，制备薄血涂片，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。
2.血脑屏障(BBB)通透性检测
感染后第5-12天，小鼠出现脑疟症状，通过尾静脉注射伊文思蓝(Evans blue)检测血脑屏障通透性变化。
3.脑组织病理及免疫组化
感染后第5天，获取各组小鼠全脑，制备石蜡切片，HE染色观察脑组织病理变化，免疫组化染色观察统计表达VCAM-1与ICAM-1的大脑皮质微血管数量。
4.脑组织mRNA检测样本的留存
感染后第5天，获取小鼠全脑，置于RNAlater中，-20℃保存，待实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测细胞因子的mRNA水平。
5.脑组织单个核细胞分离
感染后第5天，用Percoll分离全脑单个核细胞，流式细胞术检测CD4+T与CD8+T细胞水平。
6.血液学分析
感染前（第0天）及感染后第3、5、8天，经眼球取血，获得EDTA抗凝血，自动血细胞分析仪检测红细胞与血小板数量。
7.获取血清
感染前（第0天）及感染后第3、5天，经眼球取血，分离血清，-20℃冻存，待细胞因子检测。
8.制备脾脏单个核细胞悬液
感染前（第0天）及感染后第3、5天，无菌制备脾脏单个核细胞悬液，其中部分细胞经48小时培养后，收集上清，-20℃冻存，待细胞因子检测;部分细胞溶解于Trizol中，-70℃冻存，待Real-Time PCR检测细胞因子的mRNA水平;部分细胞用于流式细胞术检测不同免疫细胞亚群的水平。
9.流式细胞术
流式细胞术检测感染后第5天脑组织单个核细胞中CD4+T与CD8+T细胞的水平，感染前（第0天）及感染后第3、5天脾脏中Th1细胞、调节性T细胞（Tregs）水平、不同树突状细胞(DCs)亚群及其功能相关分子的水平，外周血活化血小板的水平。
10.Real-Time PCR
Real-Time PCR检测感染后第5天脑组织及第3、5天脾细胞脑疟相关细胞因子的mRNA水平。
11.酶联免疫吸附测定(ELISA)
ELISA检测感染前（第0天）及感染后第3、5天脾细胞培养上清与血清中细胞因子水平。
12.Griess法
Griess法检测感染前（第0天）及感染后第3、5天脾细胞培养上清中NO2-浓度。
13.统计学分析
使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异，采用Kaplan-Meyer方法进行生存期分析。P＜0.05为显著差异。
实验结果:
rhTPO可以显著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠的实验性脑疟的发生，但不改变原虫血症。rhTPO明显抑制感染小鼠血脑屏障对伊文思蓝的通透性。rhTPO抑制感染小鼠脑部炎性反应的升高。脑组织切片的HE染色结果显示，rhTPO处理感染组的脑皮质血管炎性细胞聚集与粘附现象明显少于感染对照组。脑部单个核细胞中CD4+T与CD8+T细胞水平，在rhTPO处理组明显低于感染对照组。与感染对照组相比，在rhTPO处理组，脑部与脑疟发生密切相关的炎性细胞因子(IFN-γ、TNF-α)和趋化因子(CXCL9与CXCL10)的mRNA水平明显下调，MMP-9的mRNA水平降低，而TGF-β1的mRNA水平显著升高。脑组织免疫组化结果显示，在rhTPO处理组，表达粘附分子VCAM-1与ICAM-1的大脑皮质微血管数量显著低于感染对照组，与此相一致的是，脑部VCAM-1与ICAM-1的mRNA水平，在rhTPO处理组明显低于感染对照组。血清细胞因子的ELISA检测结果显示感染后第5天，rhTPO处理组的IFN-γ、TNF-α水平显著低于感染对照组。脾脏的相关指标检测表明rhTPO能够显著影响机体的免疫应答。与感染对照组相比，rhTPO处理感染组的Th1免疫应答显著降低，表现为感染后第3、5天Th1细胞水平下降，脾细胞产生的NO减少，感染后第5天的IFN-γ与TNF-α蛋白及mRNA水平明显下调，而Tregs水平显著升高。感染后第3天，rhTPO处理感染组的髓样树突状细胞(mDCs)及DCs功能相关分子(MHCII、CD86、TLR4、TLR9)水平明显低于感染对照组。rhTPO介导保护作用的同时，不影响外周血红细胞与血小板数量，但降低感染后第3天的活化血小板水平。
结论:
1.rhTPO能够显著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠实验性脑疟的发生;
2.rhTPO可明显抑制实验性脑疟模型小鼠血脑屏障通透性的增加;
3.rhTPO能够明显降低实验性脑疟模型小鼠的脑部炎性反应;
4.rhTPO可以显著降低实验性脑疟模型小鼠Th1免疫应答，下调髓样树突状细胞(mDCs)水平及DCs功能相关分子(MHCⅡ、CD86、TLR4、TLR9)的水平，升高Tregs的水平。