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胃癌是我国常见恶性肿瘤之一,死亡率占消化道肿瘤第一位。尽管胃癌早诊、手术和化疗方面都有很多进展,但目前5年生存率仍很低。深入理解其致病机制并研发新的治疗药物仍是胃癌领域的研究热点。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径,其功能失调可促进肿瘤发生、发展和转移,是近年抗肿瘤药物开发的主要靶点之一。ROC1蛋白是SCF-E3泛素化连接酶(SCF)的一个指环型亚基,其主要功能是促进SCF及时降解各种底物,包括细胞周期调节子、转录因子和信号转导子等。ROC1-SCF E3连接酶功能紊乱可导致包括肿瘤在内的一系列疾病。已有研究显示ROC1蛋白与多种人类肿瘤(包括肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌)有关,并与肿瘤细胞死亡及生长相关,提示ROC1可作为候选的的抗癌新靶标。但目前尚未见关于ROC1与胃癌的研究报道。本研究旨在应用临床标本探讨胃癌组织ROC1的表达及其临床意义,在细胞水平观察其对胃癌生物学行为的影响及初步探讨其分子机制,为深入理解ROC1的生物学功能和探索其用于胃癌靶向治疗的潜能提供依据。目的一、ROC1在胃癌组织中的表达及其临床意义1、ROC1在胃癌组织中的表达。2、ROC1表达水平与胃癌临床病理参数的关系3、ROC1表达水平与抗凋亡基因Bcl-xl、细胞增殖核抗原Ki67表达水平的相关性4、ROC1表达水平与胃癌生存预后的关系二、ROC1基因表达沉默对胃癌细胞生物学特性的影响1、ROC1-siRNA对胃癌细胞ROC1蛋白的干扰效果2、RNAi ROC1对胃癌细胞生长、细胞周期及细胞凋亡的影响3、RNAi ROC1对胃癌细胞细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)P21(?)口P27的表达的影响方法一、1、免疫组化法检测59对配对胃癌组织与癌旁组织石蜡切片ROC1的表达,分析胃癌组织与癌旁组织中ROC1表达的差异；2、免疫组化法检测83例胃癌组织石蜡切片ROC1的表达,分析ROC1表达水平与胃癌临床病理参数的关系；3、免疫组化法检测83例胃癌组织石蜡切片ROC1、Bcl-x1及Ki67的表达,分析ROC1与抗凋亡基因Bcl-x1、细胞增殖核抗原Ki67的关系；4、免疫组化法检测83例胃癌组织石蜡切片ROC1的表达,分析ROC1表达水平与胃癌生存预后的关系；二、1、培养人胃癌MGC803细胞,利用脂质体分别将ROC1-siRNA和阴性对照siRNA转染入MGC803细胞,转染后48h、72h和96h通过western blot方法检测RNA干扰组、阴性对照组细胞ROC1蛋白表达,观察ROC1-siRNA对胃癌细胞ROC1蛋白的干扰效果；2、培养细胞、将ROC1-siRNA和阴性对照siRNA转染入胃癌细胞方法同前,于转染后24h、48h、72h和96h通过CCK8法检测RNA干扰组、阴性对照组和空白对照组细胞生长情况；于转染后0h、24h、48h和72h通过PI染色-流式细胞仪法检测RNA干扰组和阴性对照组细胞的细胞周期和细胞凋亡情况；3、培养细胞、将ROC1-siRNA和阴性对照siRNA转染入胃癌细胞方法同前,于转染后48h、72h和96h通过western blot方法检测RNA干扰组和阴性对照组细胞ROC1、P21和P27蛋白的表达,以观察RNAi ROC1对胃癌细胞抑癌基因P21和P27表达的影响。结果一、1、ROC1在胃癌和癌旁组织中的表达：主要定位于细胞核和细胞浆,呈淡黄至棕黄、棕褐色；ROC1在胃癌中的阳性率为100%,其中低表达32例(55.2%),高表达26例(44.8%)；在癌旁组织中的阳性率为93.2%,其中低表达55例(100%),高表达0例。ROCl在胃癌中的表达显著高于癌旁组织(卡方值为36.075,P值为0.000)。2、ROCl表达升高与TNM分期及5年生存率呈高度相关(P均<0.01)。ROC1高表达组患者胃癌晚期(Ⅲ-Ⅳ期)率为50.0%(20/40),ROC1低表达组患者胃癌晚期(Ⅲ-Ⅳ期)率为20.9%(9/43),差异有统计学意义(P<0.01)；ROC1高表达组患者5年生存率为27.6%(8/29),ROC1低表达组患者5年生存率为77.3%(17/22),差异有统计学意义(P<0.01)；ROC1表达与性别、远处转移、肿瘤浸润程度高度可疑相关。3、经Spearman秩相关检验,ROC1与抗凋亡蛋白Bcl-xl表达呈显著正相关(r=0.352,P<0.01)；ROC1与细胞增殖核抗原Ki67表达呈显著正相关(r=0.244,P<0.05)4、ROC1高表达组患者5年生存率为27.6%(8/29),ROC1低表达组患者5年生存率为77.3%(17/22),差异有统计学意义(P=0.001)。在单因素分析中,除了肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期之外,ROC1的表达也与预后相关。截至最后一次随访时间(2011年5月),ROC1低表达患者的生存率明显高于高表达患者(x2值为11.742,P值<0.01)。Cox多因素回归分析提示,肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移以及ROC1、Bcl-xl和Ki67的表达均是判断胃癌患者预后的独立因素。伴有淋巴结转移、伴有远处转移、ROC1高表达或Bcl-xl高表达,患者死亡的风险更高。二.1、ROC1-siRNA干扰有效：ROC1干扰组细胞ROC1蛋白的表达较阴性对照组明显降低(F=12.066,P=0.025),平均降至29%；2、ROC1干扰组胃癌细胞生长减慢,生长受到抑制：CCK8法检测细胞增殖情况,与阴性对照组相比,干扰组细胞增殖速度明显减慢并呈时间依赖关系(最低降至60%),有统计学差异(F=31.099,P=0.000)；流式细胞术分析表明,转染48、72h后,与阴性对照组相比,ROC1干扰组凋亡细胞比例增加(P均<0.01)。综合表明,ROC1表达受干扰后,肿瘤细胞体外生长受显著抑制。3、伴随着ROC1干扰组ROC1蛋白表达受到显著抑制, ROC1干扰组P21和P27蛋白表达均较阴性对照组显著上调(P均<0.01)。结论一、1、ROC1蛋白在胃癌中的表达较其对应癌旁组织显著上调,提示ROC1可能在胃癌的发生发展中起作用。2、ROC1蛋白表达升高与胃癌临床晚期、较差预后显著相关,ROC1高表达组患者胃癌晚期率较高且5年生存率较低；提示ROC1可能对促进胃癌的发生发展有重要意义。3、ROC1蛋白表达与抗凋亡基因Bcl-xl以及细胞增殖相关核抗原Ki67的表达呈显著正相关,提示ROC1可能通过促进抗凋亡及导致细胞增殖失控的途径以促进胃癌的发生发展。4、ROC1高表达患者5年生存率显著降低,提示其可能成为预测胃癌预后的有力标志物。二.1、ROC1-siRNA可显著降低胃癌细胞MGC803ROC1的表达；2、通过ROC1-siRNA干扰,胃癌细胞体外生长受显著抑制及凋亡增加；为胃癌靶向治疗的研究提供了新的实验依据。3、通过ROC1-siRNA干扰ROC1表达可显著提高胃癌细胞抑癌基因P21和P27的表达,提示了ROC1沉默可抑制肿瘤细胞生长及增加肿瘤细胞凋亡的可能作用机制。