研究背景先天性小耳畸形是一种常见的先天性结构畸形,其具体病因仍不明确。第一,有研究通过动物实验发现耳颌畸形的动物有胚胎期耳颌供养血管出血和血肿的证据,据此推测,胚胎耳发生原基或胎耳局部各种原因导致的缺血缺氧,可能致使耳软骨细胞发生畸变,从而造成耳廓及相关结构发育异常。第二,组织工程是小耳畸形新兴的治疗手段,软骨细胞常作为种子细胞被应用于组织工程相关研究,软骨细胞在体外培养时一般在常氧（21%氧含量）下进行,而实际生理条件下由于缺乏血管组织,软骨细胞生存微环境氧含量常在10%以下（甚至1%以下）,按照21%氧含量培养软骨细胞,这有悖于其生理环境,这种异常氧环境的影响,可能致使软骨细胞在生物学功能上有别于其原有情况。因此基于以上两点,有必要探究耳软骨细胞在不同氧含量下的生物学特性,探索低氧环境是否可能导致耳软骨细胞发生畸变,并指导软骨细胞体外培养的氧浓度选择,同时,从非标记定量蛋白质组学和非靶向代谢组学两个层面分析,筛查低氧对软骨细胞影响的差异化蛋白质和差异化代谢物,进而探索低氧对软骨细胞影响的潜在基因、蛋白、通路等。此外,笔者在临床工作中发现ABO血型与小耳畸形间似乎存在着一定关系,而目前两者之间的相关性未见文献报道,因此拟从ABO血型角度出发,试图为小耳畸形病因学研究提供一定思路。研究目的1.研究不同氧含量在不同培养时间下对耳软骨细胞形态、增殖、凋亡、迁移情况的影响,探索低氧环境是否可能导致耳软骨细胞发生畸变,并指导软骨细胞体外培养的氧浓度选择。2.通过低氧对兔耳软骨细胞影响的非标记定量蛋白质组学和非靶向代谢组学研究,筛查差异蛋白质、差异代谢物,寻找相关基因、通路等。3.探讨ABO血型与先天性小耳畸形的相关性。研究方法1.氧含量对兔耳软骨细胞形态、增殖、凋亡、迁移的影响研究:日本大耳白兔6只,提取耳软骨细胞,以P2代细胞为研究对象。实验分为5组:A组（21%氧,对照组）、B组（5%12h）、C组（5%36h）、D组（1%12h）和E组（1%36h）。倒置显微镜对细胞进行形态学观察。CCK-8法检测各组细胞增殖能力。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒联合流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。2.低氧对兔耳软骨细胞影响的非标记定量蛋白质组学研究:日本大耳白兔3只,提取耳软骨细胞,以P2代细胞为研究对象。实验分两组:A组（21%氧,对照组）和E组（1%36h）。应用非标记定量蛋白质组学技术检测两组细胞的蛋白质谱,筛查两组间蛋白丰度差异倍数≥2（上调2倍）或者≤0.5（下调2倍）,且p<0.05者为组间差异蛋白质。将差异蛋白质采用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）行生物信息学分析。3.低氧对兔耳软骨细胞影响的非靶向代谢组学研究:日本大耳白兔9只,提取耳软骨细胞,以P2代细胞为研究对象。实验分为两组:A组（21%氧,对照组）和E组（1%36h）。应用气相色谱-飞行时间质谱技术行非靶向代谢组学研究,检测两组细胞的代谢物,对筛查出的代谢物进行单维和多维统计学分析,取两者的并集为筛查出的差异代谢物,并对筛查出的差异代谢物行Hsa通路富集分析。4.收集2015年12月1日至2017年12月31日就诊于中国医学科学院整形外科医院的全部先天性小耳畸形患者作为病例组,2017年1月1日至2019年2月28日同一医院收治的非畸形患者作为对照组。2组均采用试管凝集法检测ABO血型。统计2组患者ABO血型分布。采用卡方检验比较2组间总体血型分布的差异,检验水准α=0.05。若结果存在统计学差异,进一步采用Bonferroni校正在4种血型间进行两两比较,同时调整检验水准α’=0.0083。采用Woolf法计算相对危险率及95%可信区间,以评估不同血型患者罹患先天性小耳畸形风险。5.统计学方法:单维统计学分析时,两组间比较采用t检验、u检验,多组间比较采用单因素方差分析（LSD-t检验）。多维统计学分析采用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。均以p<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.氧含量对耳软骨细胞形态、增殖、凋亡、迁移的影响研究:细胞形态学观察示,在1%、5%、21%氧含量条件下,兔耳软骨细胞在大体形态学上无明显差异,未见明显畸变。在细胞增殖方面,在细胞生长第六天时,5组之间差异有统计学意义（F=4.207,p=0.012）,其中D组和A组、E组和A组之间有统计学意义。在细胞生长第七天时,5组之间差异有统计学意义（F=2.948,p=0.046）,其中D组和A组、E组和A组之间有统计学意义。在细胞凋亡方面,5组软骨细胞间差异有统计学意义（F=7.957,p=0.001）,其中,D组与A组、E组与A组、B组与D组、C组与E组之间有统计学意义。在细胞迁移方面,12小时5组软骨细胞迁移率之间差异有统计学意义（F=3.287,p=0.027）,其中,D组与B组、C组与E组之间有统计学意义。24小时5组软骨细胞迁移率之间差异有统计学意义（F=3.513,p=0.021）,其中,E组与A组、E组与C组之间有统计学意义。2.低氧对兔耳软骨细胞影响的非标记定量蛋白质组学研究:低氧对兔耳软骨细胞影响的差异蛋白共计493个,其中上调种类261个,下调种类232个。对所有差异化蛋白行GO富集分析示:①基因参与的生物过程主要涉及9项,依次为:胚胎后发育、细胞对氨基酸饥饿的反应、DNA损伤检查点、TOR信号的正向调节、多细胞生物生长的调控、磷脂酰肌醇磷酸化、前miRNA加工、肠道吸收、NIK/NF-kB信号的正调控。②基因所处的细胞位置为:细胞质、核质、细胞质mRNA加工体。③基因的分子功能主要涉及:蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、3’-5’核酸外切酶活性。对所有差异化蛋白行KEGG Pathway富集分析,得到的通路共20条,分别为:mTOR信号通路、内吞作用、甲状腺激素信号通路、子宫内膜癌、丙型肝炎、FOXO信号通路、前列腺癌、胰岛素抵抗、核苷酸切除修复、鞘脂信号通路、乙型病毒性肝炎、磷脂酰肌醇信号系统、AMPK信号通路、醛固酮的合成和分泌、胰岛素信号通路、卵母细胞减数分裂、FcγR介导的吞噬作用、胰腺癌、孕酮介导的卵母细胞成熟、PI3K-Akt信号通路。3.低氧对兔耳软骨细胞影响的非靶向代谢组学研究:低氧对兔耳软骨细胞影响的差异代谢物共有9种,其中上调代谢物有1种,为苏氨酸,其余8种为下调代谢物,分别为2-苯乙酰胺、棕榈油酸、棕榈酸、5-磷酸核糖、油酸、榄香酸、肌醇-4-磷酸、十六烷基甘油。差异代谢物在hsa库富集的代谢通路分别为:①缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成;②磷酸戊糖途径;③肌醇磷酸代谢;④苯丙氨酸代谢;⑤甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑥脂肪酸代谢;⑦氨基酸tRNA的生物合成;⑧嘌呤代谢;⑨卟啉与叶绿素代谢。4.先天性小耳畸形组共收集2317例患者,各血型分布情况为:A型29.39%（681/2317）、B 型 31.89%（739/2317）、AB 型 9.75%（226/2317）、O 型 28.97%（671/2317）,血型分布特征为B>A>O>AB;对照组共收集5411例患者,血型分布特征为O>B>A>AB。2组患者ABO血型分布特征比较差异有统计学意义（χ2=8.387,P=0.039）。A型血与O型血患者先天性小耳畸形发病率差异有统计学意义差异（χ2=7.448,P=0.006）。O型血患者先天性小耳畸性发病风险显著低于其他患者（OR=0.863,95%CI:0.776～0.960,P=0.007）,而A型血患者先天性小耳畸性发病有高于其他患者的趋势（OR=1.110,95%CI:0.997～1.236）。研究结论1.当耳软骨细胞微环境中氧含量不低于1%时,可能不会导致耳软骨细胞明显畸变。当超过12小时的培养时长时,在1%氧、5%氧和21%氧3种条件下,1%氧含量可使细胞增殖率更高、凋亡率更低、迁移率更高,氧含量高低对软骨细胞生物学特性的影响大于干预时间长短对其产生的影响。2.低氧对兔耳软骨细胞影响的差异化蛋白共计493个,其中上调种类261个,下调种类232个。对所有差异蛋白行GO富集分析得到数个相关基因,行KEGG Pathway富集分析得到20条相关通路。低氧对兔耳软骨细胞影响的差异代谢物共9种,其中上调代谢物1种,下调代谢物8种,差异代谢物在Hsa库富集的代谢通路共有9条。3.在本院诊治人群中,ABO血型与先天性小耳畸形的发生存在相关性,O型血为其潜在保护因素,A型血呈现先天性小耳畸形易感趋势。