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甘蔗是重要的糖料和能源作物,广西是世界第二大产糖省(区),甘蔗栽培面积占全国的60％以上,氮肥投入约9.3亿元/年。大量的氮肥投入增加了甘蔗生产的成本,降低了甘蔗生产的效益,同时对生态环境造成严重的负面影响,挖掘甘蔗本身的固氮潜能可能足解决这一问题的有效途径。本研究通过对固氮菌的分离、鉴定、固氮特性和在甘蔗体内的生长繁殖动态,以及入侵甘蔗后对固氮、氮代谢、激素合成等生理指标和对株高、分蘖等外观农艺性状影响的研究,探讨甘蔗内生固氮菌与甘蔗的相互作用效应,得到主要结果如下:
1.从甘蔗品种桂糖28号(GT28)根系分离到3个固氮菌株,通过形态学、生理生化和16SrDNA序列的系统发育分析确定所获得的菌株分别属植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplantica)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)和成团泛菌(Pantoeaagglomerans),分别命名为KlebsiellaplanticaL03、KlebsiellaoxytocaL09和PantoeaagglomeransA01。固氮特性研究表明,3个菌株的固氮能力对氧、氮、温度敏感,在适宜的培养条件下,A01、L03和L09的最高固氮百分率分别达到3.3％Ndfa、29.3％Ndfa和26.0％Ndfa。L03在低氮培养基上继代培养时同氮活性稳定,在高氮培养基上继代培养时固氮作用受到抑制,并随着氮含量的增加抑制作用越来越明显。
2.利用转座子诱变技术能将pPAJ1819质粒中的gfp基因转座到L03基因组中并成功表达,获得具有荧光活性的突变L03菌株(MutationL03,ML03)。ML03的菌落在紫外光下发出肉眼可见的强绿色荧光,在荧光显微镜下能观察到边缘清晰的菌落形态;ML03能定殖于ROC22组培苗的根、茎、叶以及叶鞘组织的胞内和胞间,以定殖胞内为主。在接种ML031d后,在根毛区观察到ML03从根冠及根毛侧面入侵植株;2d后在根内定殖;4d后大量定殖于根中柱外围,部分进入根中柱;7d后在茎内部的薄壁组织有大量ML03生长、繁殖;8d后ML03大量入侵输导组织和叶片叶肉细胞,同时大量定殖于叶鞘组织的胞内和胞间。
3.利用15N同位素稀释法,研究接种固氮菌对甘蔗品种B8和ROC22的生物固氮的影响,结果表明:B8和ROC22的根、茎、叶都可发生固氮作用,接种L03能提高ROC22和B8的固氮百分率,两个甘蔗品种的固氮百分率和固氮量都以10d最低,60d最高。B8在不同时期的固氮百分率和固氮量显著高于ROC22的。ROC22和B8的根系在10d、30d和60d的固氮百分率之间的差异极显著,ROC22叶片中的固氮百分率在测定范围内随时间推移均匀上升,而B8不同部位的固氮活性差异很大。ROC22和B8的平均固氮百分率都表现为叶>茎>根。除B8茎30d时固氮能力最强外,两个甘蔗品种不同器官都以60d时的固氮能力最强。说明L03的固氮作用在不同品种、同一品种的不同生长时期甚至不同器官中都有很大的差异。
4.接种L03能提高ROC22和B8不同部位的含氮量,对ROC22根和茎的作用效果都在60d时达到显著水平,对叶片含氮量的作用时期从10d开始达到显著水平,在30d和60d时达到极显著水平。B8根和叶的含氮量在接种后30d与对照有显著差异,60d时差异达到极显著水平;B8茎在接种后10d含氮量就显著提高,30d和60d时差异达到极显著水平。这说明固氮菌株L03对ROC22和B8根、茎和叶中的氮素积累都有促进作用,其中对ROC22叶和B8茎的促进作用最大。推断同一固氮菌对不同甘蔗品种的作用效应不同,同一甘蔗品种的不同部位固氮活性也有差异。
5.固氮菌液浸种茎能明显提高ROC22和B8的分蘖率,对GT28分蘖率影响不明显。对株高的效应表现为ROC22和GT28都以L09浸种茎处理的植株最高,B8以L03浸种茎的处理最高。固氮菌液浸种茎有可能促进或是抑制株高。相同固氮菌对不同甘蔗品种株高的影响不同,不同固氮菌对相同甘蔗品种的株高也有不同的效应。浸种茎菌液的固氮活性高低与分蘖率和株高之间没有明显的相关性。
6.固氮菌液浸种茎能显著提高ROC22组培苗体内的氮代谢指标,提高硝酸还原酶活性和降低铵态氮的含量。单一固氮菌处理的谷氨酰胺合成酶活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量与固氮活性呈正相关,表现为L03>L09>A01。固氮活性最低的混合菌液(Mix)处理ROC22组培苗后最大幅度提高了各氮代谢指标的含量。推断L03、L09和A01之间有拮抗作用,相互拮抗降低了Mix的固氮酶活性,但侵染到甘蔗植株后,由于不同固氮菌的作用部位不同而消除了相互拮抗的影响,使得Mix对各氮代谢指标起到最明显的提高作用。
7.接种L03能提高ROC22组培苗体内的生长素(IAA)含量、玉米素(ZR)含量和乙烯(EH)释放量,降低赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)的含量。对ZR的作用效应在处理后3d达到极显著水平,对IAA和EH的作用效应在处理后7d达到极显著水平;对GA3和ABA的抑制作用从接种后第3d起均到极显著水平。接种L03还明显提高了ABA/IAA比率、EH/IAA比率及接种3d时的ZR/IAA比率,同时降低了GA3/IAA比率和接种后7d、14d的ZR/IAA比率。对GA3/IAA、ZR/IAA和EH/IAA比率的作用峰值出现在接种后7d:对ABA/IAA比率的作用峰值出现在处理后3d。对ZR/IAA比率的作用表现为先促进后抑制,抑制作用从接种后7d持续到14d以后。这说明固氮菌接种能明显改变甘蔗内源激素的合成和释放量,对甘蔗体内的激素代谢有显著的调节作用。