长期以来,人们普遍认为妊娠期间由于存在胎盘屏障,使得母胎之间只能进行营养物质的交换而不能发生细胞的转移。近些年的研究发现,母体细胞能够在怀孕期间进入胎儿体内,并且可持续存在至成年,该现象被称为母体微嵌合;同时胎儿细胞也能进入母体,被认为是胎儿微嵌合。这种母体微嵌合在免疫缺陷病人体内发生的机率更高,极大地干扰了免疫缺陷病的产前诊断。猪在生理结构和器官大小上与人类非常相近,作为研究人类疾病的一种大动物模型越来越受到重视,其中最具有应用前景的是免疫缺陷猪模型。但是免疫缺陷猪出生时是否携带有母体来源的细胞以及母源细胞是否会影响免疫缺陷猪后续的生长与应用还未见报道。因此,本课题针对免疫缺陷猪的母体微嵌合问题进行了深入研究。我们发现母体微嵌合在免疫缺陷猪中广泛存在,并且发生微嵌合的细胞主要是T细胞。通过TCR-seq检测,我们发现母体中大多数类型的T细胞在怀孕期间都能穿过胎盘屏障进入仔猪体内,但其增殖能力有限。随后,我们还对胎儿微嵌合进行了研究,在克隆产生GFP猪时,通过对代孕受体母猪体内GFP胎儿细胞进行检测,我们发现在怀孕期间胎儿细胞也能够穿过胎盘屏障进入母猪体内。主要研究结果如下:1.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和动物克隆技术,建立了两种免疫缺陷猪。首先,我们构建了IL2RG敲除猪模型,与WT猪相比,IL2RG-/Y仔猪胸腺结构异常,胸腺小体发育不良;脾脏中的动脉周围淋巴鞘不明显,白髓含量减少,淋巴细胞数量显著降低;IL2RG-/Y猪的外周血和脾脏中T细胞、B细胞和NK细胞的比例低于WT猪;IL2RG-/Y猪能够支持人黑色素瘤细胞的生长。同时,我们还建立了RAG1和IL2RG双基因敲除的免疫缺陷猪模型,这种猪表现出更加严重的免疫缺陷症状。RAG1基因敲除后,T细胞在成熟的过程中不能发生V（D）J重排,双基因敲除免疫缺陷猪胸腺内淋巴细胞含量显著减少、上皮样细胞含量增多,皮质与髓质分界不明显,且未见明显胸腺小体;脾脏红髓和白髓界限不明显,淋巴细胞弥散,且未见明显动脉周围淋巴鞘结构。免疫组化结果显示胸腺和脾脏中无CD3+T细胞存在;流式检测分析显示双基因敲除免疫缺陷猪外周血的T细胞、B细胞和NK细胞显著降低。2.本研究以RAG1和IL2RG双基因敲除免疫缺陷猪为研究对象,对母体微嵌合进行了研究。通过荧光定量检测,我们发现在80%的脐带血和52.94%的脾脏中存在母体微嵌合,嵌合频率分别为0.05%-1.85%和0.04%-2.21%。怀孕期间穿过胎盘屏障进入仔猪体内的细胞主要由T细胞组成,它们分布在除胸腺外的多个器官当中,其中脾脏中浸入的T细胞含量最高。通过对母源T细胞进行研究,我们发现这些T细胞已经发生了V（D）J重排,并进一步证明它们是在母猪的胸腺中发育成熟的。通过TCR-seq检测分析,发现在怀孕期间,绝大多数类型的T细胞均能穿过胎盘屏障进入胎儿体内,但增殖能力有限,当仔猪受到抗原刺激时,只有极少数类型的T细胞能够进行显著增殖。结合转录组测序分析,我们发现具有母体微嵌合的猪外周血中高表达的基因主要富集在淋巴细胞趋化、淋巴细胞迁移、髓系细胞迁移和粒细胞迁移等相关的通路上,提示除了T细胞,其他类型的细胞如粒细胞和髓系细胞等也可以穿过胎盘屏障进入胎儿体内。3.在人和小鼠上的研究表明,怀孕期间细胞在母体-胎儿的这种迁移是双向的。因此,我们在克隆GFP仔猪的过程中对猪的胎儿微嵌合进行了研究。在怀有GFP仔猪的代孕受体母猪血液中检测到了GFP细胞。进一步通过流式检测,我们发现外周血中含有0.043%的GFP细胞,其中88.3%的细胞是CD3+T细胞。通过荧光显微镜观察,我们发现胎儿来源的GFP细胞主要分布在免疫器官如脾脏和淋巴结,在肺、肝、肠、脑和心脏中也观察到少量的GFP细胞,但在肾脏中没有观察到明显的GFP细胞。综上所述,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和动物克隆技术获得免疫缺陷猪以及GFP猪,并对猪的母体-胎儿微嵌合进行了系统的研究。在免疫缺陷猪中首次发现了母体微嵌合的现象,这为免疫缺陷猪的应用和人源化猪的构建提供了重要参考。在代孕受体母猪体内发现了仔猪的GFP细胞,表明怀孕期间细胞在母体-胎儿之间的迁移是双向的,提示猪可以作为一种大动物模型用于研究母体-胎儿微嵌合的问题。