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海藻酸钠降解得到的聚甘露糖醛酸(Polymannuronic acid,PM)和聚古罗糖醛酸(Polyguluronic acid,PG)具有优良的生物活性。二者生物活性的发挥与其给药方式密切相关,而口服给药系统是各种给药途径中最广泛使用的方式,因此阐明PM和PG的口服转运过程对其生物活性的发挥具有重要意义。药物的口服转运途径主要包括跨细胞途径和细胞旁途径:多糖由于分子量(Molecular weight,Mw)大,难以透过细胞间的紧密连接(Tight junction,TJ),因此细胞旁途径严重限制了其口服转运过程。而多糖的跨细胞途径包括:从顶膜内吞的多糖分子在细胞中内化,并最终从基底外侧膜中胞吐。为了研究PM和PG的口服转运机制,本实验采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的方法合成FITC-PM和FITC-PG,然后在Caco-2细胞单层模型上研究了二者的转运机制。具体研究内容包括以下几个方面:1、PM和PG的荧光标记及验证采用酪胺化学修饰与FITC缀合的方法合成FITC-PM和F.ITC-PG,琼脂糖凝胶电泳法和荧光分光光度计法的结果表明PM和PG已成功被FITC标记;高效凝胶渗透色谱法的结果显示荧光标记后的PM和PG的Mw有稍微增加,这可能是酪胺和FITC基团缀合在PM和PG分子上的结果;荧光强度的测量实验结果表明FITC-PM和FITC-PG的荧光标记率分别为12.66%和9.52%。2、FITC-PM和FITC-PG在Caco-2细胞单层模型的转运机制使用0.4 μg/mL嘌呤霉素建立7天Caco-2细胞单层模型,然后在此模型上考察了时间、浓度、温度、抑制剂等对样品转运的影响。转运时间考察结果表明二者转运量随时间延长而增加,240 min时转运和外排速率相对平衡。转运浓度的考察结果显示二者的转运量不随浓度变化而变化,且表观渗透系数(Apparent permeability coefficient,Papp)值与转运量和浓度均呈负相关,这表明二者的转运有载体饱和性。温度的考察结果显示低温能显著抑制二者的转运(相对转运量分别降低90%和81%),这表明二者的转运是能量依赖性的。转运抑制剂的考察结果显示随着氯丙嗪,dynasore,甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin,MβCD)或 5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride,EIPA)的加入,FITC-PM 的转运量降低了 19%、65%、34%和 61%,FITC-PG 的转运量降低了 58%、47%、22%和 20%。这表明二者通过巨胞饮途径、网格蛋白介导的内吞途径和小窝(或脂筏)介导的内吞途径进入Caco-2细胞。使用siRNA技术沉默网格蛋白重链、发动蛋白-Ⅱ或小窝蛋白-1后,药物转运实验结果显示FITC-PM的转运量降低了 19%、80%和27%,FITC-PG的转运量降低了 66%、30%和24%,这表明网格蛋白、发动蛋白-Ⅱ和小窝蛋白参与了二者的转运。细胞内抑制剂实验结果表明当添加莫能菌素和巴弗洛霉素A1时,FITC-PM的转运量降低了 66%和54%,FITC-PG的转运量分别降低了 40%和64%,这表明内体成熟过程对PM和PG的运输至关重要。诺考达唑的添加使得FITC-PM的转运量降低了 39%,但对FITC-PG的相对转运量无影响,表明微管参与PM在Caco-2细胞的运输,但可能不参与PG的转运。3、吸收促进剂对FITC-PM和FITC-PG转运的影响。壳聚糖(Chitosan,CS)对TJ的影响实验表明CS可以可逆打开细胞间的TJ。随后将Caco-2细胞与CS合用,结果显示合用之后二者的Papp值分别比对照组高1.9倍和2.6倍,表明添加CS会显著增加二者在Caco-2细胞的转运。Western blotting实验结果显示CS打开TJ可能与CS会导致TJ相关蛋白(主要是CLDN4和occludin蛋白)的表达降低有关。综上所述,本课题以FITC荧光标记了 PM和PG,然后研究了 FITC-PM和FITC-PG跨肠上皮细胞单层的转运机制,结果表明FITC-PM和FITC-PG的转运是时间和能量依赖性的,其内吞途径包括巨胞饮途径、网格蛋白介导的内吞途径和小窝(或脂筏)蛋白介导的内吞途径;二者在Caco-2细胞中的运输过程取决于内体的酸化;同时微管介导FITC-PM的转运,但不介导FITC-PG的转运。此外,CS通过可逆打开TJ的方式促进了 FITC-PM和FITC-PG的转运量。本研究提供了一份关于小肠上皮细胞中PM和PG的吸收转运机制的详细报告。