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目的第一部分：探讨获取高纯度大鼠原代脑微血管周细胞的分离和培养方法,并对其鉴定。第二部分：探讨褪黑素在过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠脑微血管周细胞损伤中的保护作用。第三部分：探讨褪黑素抑制H2O2诱导的大鼠脑微血管周细胞凋亡的保护机制。方法第一部分：选取10只3周龄Wistar大鼠,取大脑,去除白质,剪碎成大约1mm3大小,通过两次酶消化、20%BSA离心和33%连续密度Percoll梯度离心获得纯度较高的大脑微血管片段,接种于35mm培养皿中,加入含10%FBS的DMEM培养基,37℃、5%CO2细胞孵箱中培养,2天后更换新鲜培养基；采用倒置显微镜观察周细胞生长状况及其形态；免疫细胞化学法检测NG2、α-SMA、vWF及GFAP表达,鉴定分离的细胞及其纯度；MTT法检测绘制其增殖曲线。第二部分：应用MTT试验和台盼蓝拒染试验检测不同浓度H2O2处理后脑微血管周细胞的细胞活力；应用胞内反应性氧簇检测试剂盒检测褪黑素及抗化剂GSH对胞内活性氧聚集的影响；采用TUNEL法确定细胞死亡类型；检测褪黑素及GSH对H202诱导大鼠脑微血管周细胞损伤的保护作用。第三部分：检测褪黑素及抗氧化剂GSH对H2O2诱导的脑微血管周细胞调亡过程中关键蛋白Caspase-3的活性影响；应用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达,观察褪黑素在H2O2诱导脑微血管周细胞凋亡中的作用。结果第一部分：培养5天左右可见周细胞从贴壁的脑微血管片段周围长出；培养的周细胞成不规则外形,在某些区域可重叠生长；8～10天可形成汇合；脑周细胞拥有长的细胞突触、较大的细胞体及圆形的细胞核；免疫细胞化学染色结果显示脑微血管周细胞NG2和α-SMA表达阳性,并可同时表达这两种标志物,而对vWF和GFAP两种蛋白的免疫反应呈阴性,排除了内皮细胞和星形胶质细胞的存在；培养的周细胞纯度达96%以上；在培养到第10天左右增殖至顶峰。第二部分：MTT结果显示,H202处理脑微血管周细胞可引起剂量依赖的细胞毒性作用；使用0.05mM、0.1mM和0.2mM H202作用脑微血管周细胞2h可分别导致大约12%、25%和28%的细胞死亡(P<0.05),当使用0.5mM H202处理时可诱导大约38%的细胞死亡(P<0.01)；而当使用1mM H202处理时会诱导大部分(78%)周细胞死亡；应用台盼蓝拒染试验也得到了一致的结果；胞内活性氧检测结果显示使用褪黑素或抗氧化剂GSH预孵育可分别降低胞内活性氧大约27%或36%。；TUNEL实验结果表明,H202诱导的脑周细胞死亡是由凋亡介导的；与H202处理组相比,褪黑素(0.1mM)预处理可减少一半数量的H202诱导的TUNEL-阳性细胞；抗氧化剂GSH(0.5mM)也可降低H202诱导的周细胞凋亡。第三部分：H2O2(0.5mM)处理脑周细胞可显著增加Caspase-3活性,与对照相比增加约2.24倍(P<0.05),应用褪黑素(0.1mM)或GSH(0.5mM)预孵育后可减弱H202引起的Caspase-3活性的增加,与H202-处理组相比降低约19%(P<0.01)；Western blot结果显示,与对照组相比,H202(0.5mM)处理周细胞(2h)可显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下降约50%(P<0.05)；与H202处理组相比,使用褪黑素(0.1mM)预处理可上调Bcl-2的表达,大约增加3倍(P<0.01)；但是,对促凋亡蛋白Bax的影响很小,发现对照组与处理组均表达很低。结论第一部分：该方法可成功获得纯度较高的原代大鼠脑微血管周细胞。第二部分：褪黑素可抑制H202-诱导的脑微血管周细胞凋亡,验证了其抗凋亡作用。第三部分：褪黑素可通过降低Caspase-3活性及上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来发挥抗凋亡作用。