论文部分内容阅读
肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性(Multidrug resistance，MDR)是造成肿瘤化疗失败的主要原因，MDR的形成机制很多，但能在临床得到验证的耐药机制很少，其中对由P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)介导的耐药机制的研究最为广泛和深入，并在临床得到了证实。PGP不仅与耐药相关，而且还与肿瘤的侵袭、转移等生物学特性相关，因此以PGP为靶点制备抗PGP的单克隆抗体成为治疗耐药肿瘤的最新策略。与其他特异性的肿瘤抗原不同，在所有正常人类组织中均可检测到PGP及mdr-1基因的mRNA，许多研究证明PGP与正常细胞的分泌功能密切相关。而且，越来越多的研究表明PGP是人体保护正常细胞免受毒物损害的机制之一。这就要求单抗本身不抑制PGP的正常功能，而且也不能携带对正常细胞具有杀伤活性的外源性毒物。双特异抗体(bispecific antibody，BsAb)通过激活人体内的效应细胞发挥杀伤肿瘤细胞的作用，从而避免了使用外源非特异细胞毒物质，这就使抗PGP抗体应用于耐药肿瘤的治疗提供了可能。 HIT3a是我所研制的鼠源性抗CD3的单克隆抗体，并已经过国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名。PHMA02为本实验室自行研制的具有自主知识产权的抗PGP的鼠源性单克隆抗体我们克隆单克隆抗体HIT3a和PHMA02轻、重链可变区基因，构建表达了抗PGP×抗CD3 diabody，并对其体内外活性进行深入研究。 我们利用RT-PCR克隆了抗PGP单抗PHMA02的轻、重链可变区基因，并利用噬菌体抗体库技术构建了抗PGPscFv的抗体库并进行了筛选。筛选到的高亲和力克隆经序列测定和氨基酸序列分析为一典型的抗体序列。将筛选到的高亲和力抗体基因克隆到具有强启动子的PET28a(+)载体上进行表达，表达产物具有与靶抗原PGP特异结合的能力，但不抑制PGP外排泵的功能。在此基础上，利用抗体HIT3a和PHMA02轻、重链可变区基因，构建表达了抗PGP×抗CD3 diabody，并实现了在大肠杆菌内的分泌性的