产几丁质酶卵寄生真菌存厚垣普奇尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)对根结线虫生防潜力的研究

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根结线虫(Meloidogynespp.)是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物之一。该病害严重威胁我国保护地蔬菜和果树的生产。化学杀线剂给环境乖农产品带来安全隐患,而利用天敌真菌防治植物线虫病害的生防措施成为替代措施之一。   本研究对从7株不同来源的根结线虫卵寄生真菌—厚垣普奇尼亚菌进行了生物学和生化特性及其对南方根结线虫的生防潜力的研究。   1采用玻片和平板菌落培养的方法,对7株不同来源的卵寄生真菌—厚垣普奇尼亚菌进行了形态学观察和比较。结果表明,不同菌株在形态和培养性状上存在明显差异。各菌株在CMA培养基上的生长速率不同,CFCC80919生长最快,气生菌丝发达;CFCC80919和CFCC84964菌落背面乳白色;QNAV97-5分生孢子梗细长。7个菌株均能够产生菌丝膨大和厚垣孢子,其中QNAV97-6和CFCC84963厚垣孢子着生方式除间生外还有侧生,NRRL13094厚垣孢子大量间生成串,CFCC84964和CFCC84963厚垣孢子稀少。QNAV97-2、QNAV97-5、CFCC84963、NRRL13094和CFCC80919能产生晶体。   2厚垣普奇尼亚菌各菌株在玉米粉液体培养基内产生厚垣孢子的能力不同,菌株CFCC84964产厚垣孢子能力最强,菌株CFCC84963产厚垣孢子能力最弱。在第2d,7个菌株都没有产生厚垣孢子;第4d厚垣孢子的产生出现差异,菌株QNAV97-2、QNAV97-6、CFCC84964和CFCC80919开始有厚垣孢子产生;第20d,菌株CFCC84964厚垣孢子可达到106.65×104个/mL,菌株CFCC84963厚垣孢子仅有29.12×104个/mL。   37株厚垣普奇尼亚菌在含有0.2%胶体几丁质(colloidalchitin)为主要C源和N源的半液体培养基内,他们的培养滤液存在明显差异。其中QNAV97-5、QNAV97-6和CFCC84963培养滤液未测定出几丁质降解酶活性。具有几丁质降解酶系的4个菌株从第2d开始测定出活性,CFCC80919酶活性上升迅速,第12d就达到酶活性高峰值10.99μmol/hmL,随后缓慢下降;而QNAV97-2和CFCC84964第24d达到酶活性高峰,分别为21.39μmol/hmL和17.30μmol/hmL,至32d仍保持高峰活性水平;NRRL13094第28d达到酶活性高峰值15.79μmol/hmL,随后略有下降。   47株厚垣普奇尼亚菌从第2d开始均能产生几丁质外切酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase)。其中CFCC80919、CFCC84964培养滤液第6d达到酶活性高峰,至32d一直保持高水平活性,稳定在0.21-0.23μmol/hmL之间;而QNAV97-2培养滤液酶活性第4d快速上升至0.13μmol/hmL,随后下降,20d后又明显上升,第28d达到高峰值0.20μmol/hmL;NRRL13094培养滤液酶活性第14d达到高峰值0.09μmol/hmL,随后下降。在未测定出几丁质降解酶系的3株厚垣普奇尼亚菌中,QNAV97-6和CFCC84963培养滤液几丁质外切酶活性较高,第6d达高峰值,分别为0.21μmol/hmL和0.17μmol/hmL;QNAV97-5酶活性缓慢上升,至30d达高峰值0.13μmol/hmL。   5应用含0.01%糖基化几丁质的改良SDS-PAGE电泳检测厚垣普奇尼亚菌具几丁质酶活性的蛋白谱带,并估算他们产生的几丁质酶的分子量。CFCC84964有4条几丁质酶活性谱带,分子量分别为17kDa、19.1kDa、22.9kDa和26.3kDa;CFCC80919有2条几丁质酶活性谱带,分子量分别为27.5kDa和38.9kDa;QNAV97-2有2条几丁质酶活性谱带,分子量分别为39.8kDa和50.1kDa;NRRL13094有2条几丁质酶活性谱带,分子量分别为81.3kDa和97.7kDa。厚垣普奇尼亚菌具有较高产生几丁质酶的活性,其产生的几丁质酶可以引起根结线虫卵壳的裂解,抑制根结线虫卵的孵化。   6厚垣普奇尼亚菌7个菌株的几丁质酶培养滤液对根结线虫卵孵化具有不同程度的抑制作用。28℃下培养,7个菌株的培养滤液在浓度递增的情况下,对根结线虫的卵孵化抑制率随时间的增加而递增。其中培养7d,25%浓度的培养滤液对根结线虫的卵孵化抑制率最大。比较25%浓度下各菌株对根结线虫卵孵化的抑制率可知,菌株QNAV97-2对根结线虫卵孵化的抑制率最高,7d可达到55.15%;菌株CFCC84963对根结线虫卵孵化的抑制率最低,7d达到12.14%。   7对测定出几丁质降解酶活性的4个厚垣普奇尼亚菌培养2周后,在2%水琼脂培养基上直接测定菌丝对根结线虫卵和雌虫的寄生情况。QNAV97-2、NRRL13094、CFCC84964和CFCC80919都可以寄生根结线虫的卵和雌虫,卵寄生率分别为55.62%、57.13%、47.87%和52.75%;雌虫寄生率分别为85%、90%、80%和95%。菌丝对卵和雌虫的寄生程度有差异。   综上所述,厚垣普奇尼亚菌QNAV97-2、NRRL13094、CFCC84964和CFCC80919生防潜力较高,具有应用前景。
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