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急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是白血病中的常见类型。目前只有约40%的非老年AML和约10%的老年AML通过传统的化疗可以达到长期生存。进一步探索AML的发病机制,在此基础上研究新的治疗策略,才能降低化疗相关毒副作用,提高患者的整体生存。AML的发病机制是一个多步骤的过程,由于基因调控紊乱,出现细胞分化、增殖及凋亡失控,最终导致造血干祖细胞的恶性转化。磷脂酰肌醇-3-激酶／丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase, PI3K/AKT)细胞信号转导通路是细胞内一个重要的信号通路,过度激活此通路会影响多种下游效应分子的状态,使细胞内增殖失控、凋亡受抑,促进恶性疾病的发生。PI3K/AKT途径在50%-70%的AML发病中发挥重要作用,但其具体机制不详。包含SH2区域的肌醇5’磷酸酶1(SH2 domain-containing inositol 5’-phosphatase 1, SHIP1)是一种重要的磷酸肌醇磷酸酶,通过负向调控PI3K/AKT细胞信号途径而抑制造血细胞的增殖和生存。近年的研究表明SHIP1的失活在某些恶性血液病中发挥重要作用oSHIP1基因的点突变及SHIP1功能的失活在AML中的作用已有报道,显示SHIP1在AML发病机制中发挥抑癌作用。在AML中SHIP1的点突变并不常见,因此可能存在其他导致SHIP1功能失活的机制如微小RNA (microRNA,miRNA)的转录后调控致翻译抑制、表观遗传学修饰、转录减少以及蛋白降解增加。miRNA是一组新发现的非编码的小RNA,在基因调控网络中发挥重要作用。微小RNA-155 (microRNA-155, miR-155)与SHIP1的mRNA3’UTR端结合,抑制SHIP1 mRNA的翻译。SHIP1与miR-155均表达在造血细胞,发挥的作用正好相反。一些研究显示二者具有强烈相关性,miR-155的过表达和SHIP1的敲除都会引起骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders,MPD)。相关文献报道SHIP1在B细胞中是miR-155的靶标,miR-155表达水平升高和SHIP1表达水平降低与小鼠的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)发病有关。而在人类弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)和NK/T细胞白血病中也发现miR-155水平升高和SHIP1活性降低。因此,miR-155对SHIP1的抑制可能与MPD及AML的发生发展有关。miR-155和SHIP1在AML发病机制中的作用尚需进一步研究,目前国内外文献尚无相关报道。我们的研究探讨AML患者及白血病细胞系中miR-155及SHIP1在mRNA水平及蛋白水平基因表达的情况；分别在两个细胞系U937和THP-1中转染miR-155类似物(mimics)和miR-155抑制齐(inhibitor),检测SHIP1及PI3K/AKT中的活化AKT(Phosphorylated AKT,PAKT)及总AKT (total AKT,TAKT)的表达情况,并研究转染后对白血病细胞增殖和凋亡的影响。探索miR-155是否通过作用于靶基因SHIP1激活PI3K/AKT细胞信号途径发挥致癌基因作用。本课题研究结果为进一步探讨miR-155和SHIP1在AML发病机制中的作用奠定了基础,从而为完整的阐述miRNA在AML调节机制中的作用并为靶向miRNA治疗AML提供重要依据。第一部分 急性髓细胞白血病患者及白血病细胞系中的miR-155和SHIP1的表达目的：INPP5D基因编码SHIP1,SHIP1是PI3K/AKT细胞信号转导通路的负调控因子。PI3K/AKT信号通路在50%-70%的AML发病中发挥重要作用,但其具体机制不详。有研究表明,SHIP1是miR-155的靶标之miRNA-155已证实在某些类型的AML中表达增加。本研究旨在探索miR-155及SHIP1在急性髓细胞白血病(AML)患者及细胞系的表达情况。方法：RT-PCR的方法检测30例AML患者miR-155、SHIP1的mRNA基因表达水平,选取同年龄健康人骨髓为对照组；RT-PCR的方法分别检测细胞系中miR-155、SHIP1的mRNA基因表达水平的表达。Western blot法检测AML患者及细胞系的SHIP1蛋白表达水平。根据SHIP1蛋白表达水平和AML亚型分组,比较两组的临床特点及完全缓解(completeremission,CR)率。多元回归分析影响CR的因素。结果：30例AML患者中SHIP1mRNA表达水平较正常对照组均明显下降,但AML各亚型中的mRNA表达水平无明显差异。有15例患者SHIP1蛋白水平明显降低,而miR-155表达水平相应升高(P值均<0.05),均为／AML-M4/M5亚型。miR-155是影响正常核型AML的独立预后因素。在U937、THP-1细胞系中miR-155表达水平较高,以THP-1更明显,K562细胞系中,miR-155表达水平较低,SHIP1在U937中表达明显升高。结论：在KML-M4M5患者中miR-155表达水平升高,SHIP1在蛋白表达水平降低,二者呈现负相关性。miR-155是影响正常核型AML的独立预后因素。MiR-155可能通过作用于SHIP1参与AML发病机制。在不同的细胞系中,U937和THP-1的miR-155具有一定表达水平,可用于细胞实验进一步研究miR-155在AML发病机制中的作用。第二部分过表达niR-155)对SHIP1/PI3K/AKT的调控及对U937细胞系增殖和凋亡的影响目的：miR-155主要表达在造血细胞,在恶性血液病中发挥癌基因作用。SHIP1也主要表达在造血细胞,负向调控PI3K/AKT细胞信号通路。SHIP1表现为抑癌作用,SHIP1为miR-155的靶基因之一。在AML中miR-155表达水平升高,SHIP1受抑,我们通过过表达U937细胞的miR-155,观察对SHIP1/PI3K/AKT通路的影响,对U937细胞增殖及凋亡的影响并研究其机制。探索miR-155如何作为癌基因参与AML的发病机制。方法：通过X-treme GENE siRNA Transfection Reagent在U937细胞转染miR-155 mimics(U937m),同时设置未转染组(U937c)和转染对照组(U937mc)。实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-155转染效率及转染后SHIP1的mRNA基因水平的表达。CCK-8法检测对细胞系增殖的影响。流式细胞术检测对凋亡的影响。Western blot法检测转染后的SHIP1、 AKT、pAKT蛋白水平的基因表达。结果：与U937c及U937mc相比,U937m的miR-155表达水平明显升高(p<0.05)。过表达miR-155可导致U937细胞的凋亡率明显减少(p<0.05),但对U937的增殖影响不明显(p>0.05)。过表达miR-155对U937细胞的SHIP1 mRNA含量无明显影响,但导致SHIP1蛋白水平明显降低(p<0.05),提示miR-155对U937细胞的SHIP1可能存在翻译水平的调节。miR-155的过表达未导致总／(TAKT)的蛋白含量变化,但PAKT蛋白水平明显升高(p<0.05)。结论：过表达miR-155可能通过抑制SHIP1蛋白含量,激活PI3K/AKT信号途径,抑制细胞凋亡。提示miR-155作为癌基因,对SHIP1靶向调控,激活PI3K/AKT,在AML发病机制中发挥重要作用。第三部分抑制miR-155表达对SHIP1/PI3K/AKT的调控及对THP-1细胞系增殖和凋亡的影响目的：miR-155是目前研究最多的miRNA,也是首个被发现有致癌作用的miRNA。miR-155在AML中可能通过作用于SHIP1发挥癌基因作用。miR-155是白血病治疗的非常有前景的新靶标。本研究通过转染miR-155 inhibitor下调THP-1细胞的miR-155表达,观察抑制miR-155表达对THP-1细胞增殖及凋亡的影响并研究其机制,进一步证实miR-155通过调控SHIP1/PI3K/AKT在AML发病机制中的癌基因作用,同时探索抑制miR-155对AML治疗作用的机制。方法：通过X-treme GENE siRNA Transfection Reagent在THP-1细胞转染miR-155 inhibitor(THP-1I),同时设置未转染组(THP-1c)和转染对照组(THP-1Ic)。实时定量PCR(RT-PCR)检测miR-155转染效率及转染后SHIP1的mRNA基因水平的表达。CCK-8法检测对细胞系增殖的影响。流式细胞术检测对凋亡的影响。Western blot法检测转染后的SHIP1、AKT、pAKT蛋白水平的基因表达。结果：与THP-1C和THP-1IC相比,THP-1I的miR-155表达水平明显降低(p<0.05)。抑制miR-155可导致THP-1细胞的凋亡率明显增高(p<0.05),但对THP-1细胞的增殖无明显影响(p>0.05)。抑制miR-155对THP-1细胞的SHIP1 mRNA含量无明显影响,但导致SHIP1蛋白水平明显升高(p<0.05),提示miR-155对THP-1细胞的SHIP可能存在翻译水平的调节。miR-155抑制尽管未导致总AKT (TAKT)的蛋白含量变化,但pAKT蛋白水平明显降低(p<0.05)。结论：抑制miR-155表达可能通过增加SHIP1蛋白含量,抑制PI3K/AKT信号途径,促进THP-1细胞凋亡,提示抑制miR-155可能成为抗白血病治疗的新策略。