食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,中国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家,每年全世界新诊断的30万食管癌患者中有一半以上（16.72万）发生在中国。在我国,特别是河南等省份是食管癌的高发地区,其死亡率居恶性肿瘤的第4位,且以食管鳞状细胞癌（食管鳞癌）占大多数,因此,食管癌的早期诊断、发生机制及防治研究已成为当前的热点课题。肿瘤是一类与细胞周期素（Cyclins）密切相关的疾病,细胞周期调控异常导致的细胞失控性增殖是肿瘤的重要特征。研究显示,CyclinD1是G0/G1期细胞增殖信号的关键蛋白,CyclinB1是调控细胞进入G2/M期的关键因子,二者过表达均可促进肿瘤的发生与发展。细胞凋亡与恶性肿瘤的发生、发展及治疗亦密切相关。Livin是最近发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族中的新成员,研究发现,直结肠癌、膀胱癌和肺癌等实体瘤组织和血清中可检测出Livin和抗Livin抗体异常表达;第2个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂（second mitochondria-derivedactivator caspase,Smac）是近年来发现的一种促凋亡基因,参与细胞凋亡的下游反应,研究显示:Smac高表达不仅可促进肿瘤细胞凋亡,而且可增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。肿瘤呈多因素诱导、多基因参与、多阶段发生的极其复杂的病理过程,癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活是人类肿瘤形成和发展的物质基础。肿瘤的发生似乎重现了胚胎早期发育及胚胎畸变的过程,因此,目前对于胚胎发育相关基因与肿瘤发生的研究己成为分子肿瘤学的研究热点,调控细胞发育的重要转录因子——同源异型盒基因（homeobox gene,HOX）就是其中具有代表性的一个。HOX基因的异常表达在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,其该作用可能通过参与细胞周期和/或细胞凋亡调控而实现的。研究显示,在白血病、神经系统肿瘤、宫颈癌、结肠直肠癌等多种肿瘤中已检测到HOXA5的异常表达。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由与靶基因序列相同的双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）介导的序列特异的、转录后基因沉默技术。其机制是dsRNA在细胞内经RNaseⅢ核酸内切酶（Dicer）加工成21～23 nt的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,后者可介导靶基因mRNA的降解,从而有效沉默靶基因的表达。利用RNAi技术诱导目的基因沉默具有快速、特异、高效和廉价等优点。因此,RNAi有望成为疾病基因治疗的理想手段。为深入探讨HOXA5基因与食管鳞癌发生发展、增殖及凋亡的关系,作者拟首先联合检测食管鳞癌组织中HOXA5、CyclinD1、CyclinB1、Livin和Smac的表达;然后构建针对HOXA5基因的siRNA真核表达载体,并转染食管癌EC9706细胞株,观察其对EC9706细胞生物学行为和对裸鼠移植瘤生长的影响,为探讨食管癌的发生机制及靶向治疗提供理论依据。本研究共分4个部分。第一部分食管鳞癌组织中HOXA5、CyclinB1、CyclinD1、Livin及Smac mRNA和蛋白的表达方法1.选择62例择期手术的食管癌患者,手术切除的标本均在离体30 min内分别于癌灶、癌旁3 cm以内及手术残端食管黏膜组织3处取材。2.对各部分标本作HE染色进行病理学诊断及分型。病理学证实:62例癌组织标本均为鳞癌,其中组织学Ⅰ级15例,Ⅱ级25例,Ⅲ级22例;有淋巴结转移20例,无淋巴结转移42例;肿瘤浸润深度:浸润至黏膜层、黏膜下层或浅肌层7例,深肌层14例,纤维膜41例。癌旁3 cm以内的标本均为中-重度不典型增生组织。手术残端标本均为正常食管黏膜鳞状上皮组织。3.用免疫组织化学染色方法、荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测癌灶、癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织中HOXA5蛋白和mRNA的表达情况。4.应用免疫组化SP法、原位杂交法检测食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中CyclinB1,CyclinD1蛋白和mRNA的表达情况。5.应用免疫组化SP法、RT-PCR检测食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中Livin、Smac蛋白和mRNA的表达情况。6.分析HOXA5、CyclinB1,CyclinD1,Livin、Smac蛋白和mRNA表达与食管鳞癌患者临床病理因素的关系及HOXA5蛋白和mRNA的关系。7.统计学处理:应用SPSS 12.0,采用χ²检验、t检验和方差分析。检验水准α=0.05。结果1.在正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中HOXA5蛋白阳性表达率分别为32.3%、58.1%和64.5%（χ²=14.466,P＜0.05）;HOXA5 mRNA的含量分别为（0.97±0.46）、（1.76±1.03）和（2.37±2.11）,组间比较差异有统计学意义（F=15.490,P＜0.05）;HOXA5蛋白和mRNA在癌组织及癌旁不典型增生组织的表达明显高于正常食管黏膜组织（P＜0.05）。2.HOXA5蛋白和mRNA均与食管鳞癌组织的病理学、组织学分级有关（P＜0.05）,其在组织学Ⅲ级中的表达率明显高于组织学Ⅰ、Ⅱ级;但HOXA5蛋白和mRNA的表达与患者的年龄、性别、浸润深度及有无淋巴结转移无关（均P＞0.05）。3.HOXA5蛋白表达与其mRNA的表达具有良好的一致性（r=0.718,P＜0.05）。4.CyclinB1和CyclinD1的mRNA和蛋白在正常食管黏膜组织中不表达或低表达,在癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中高表达,3者阳性表达率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。5.食管鳞癌患者癌组织中CyclinB1,CyclinD1的mRNA和蛋白的表达与性别、年龄无关;与组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移有关（P＜0.05）。6.CyclinB1,CyclinD1 mRNA与蛋白正常食管黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中的表达有高度的一致性。7.Livin蛋白在正常食管黏膜组织中低表达,在癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中高表达,阳性率分别为38.7%、61.3%和80.6%,差异有统计学意义（χ²=22.801,P＜0.05）。Smac蛋白在癌旁不典型增生组织中高表达,在正常食管黏膜组织及食管鳞癌组织中低表达,阳性率分别为67.7%、48.4%和33.9%,差异也有统计学意义（χ²=14.323,P＜0.05）。8.食管鳞癌患者癌组织中Livin和Smac蛋白的表达与性别、年龄无关;与组织学分级、浸润深度及有无淋巴结转移有关（P＜0.05）。9.Livin和Smac蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈负相关（r=—0.516,P＜0.05）。10.食管鳞癌组织中HOXA5蛋白和CyclinB1,CyclinD1,Livin蛋白的表达呈正相关,与Smac蛋白的表达呈负相关。第二部分pRNAT-U6.1-siHOXA5表达载体的构建及其对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响方法1.根据GenBank提供的HOXA5基因mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到112～130 nt,193～211 nt和726～744 nt 3个19～21 bp片段为靶序列。2.设计包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的3对靶向HOXA5发卡样DNA寡核苷酸和一对随机对照发卡样DNA寡核苷酸,并克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组干扰表达载体。3.通过PCR技术和测序方法鉴定重组载体。4.将构建好的4种siRNA表达载体转染EC9706细胞,同时设空载体对照组（转染pRNAT-U6.1空载体的细胞）及空白对照组（未转染的细胞）,RT-PCR检测siRNA表达载体转染EC9706细胞后对HOXA5 mRNA的抑制作用,从而筛选出干扰效率最强的表达载体。5.利用该载体转染EC9706细胞后,应用MTT法检测siRNA转染对EC9706细胞形态和增殖能力的影响,应用流式细胞术（flow cytometry,FCM）、DNALadder研究其细胞周期和细胞凋亡的变化,通过RT-PCR、Western blotting法分别研究转染前后HOXA5 mRNA及蛋白表达的变化。结果1.siRNA发卡DNA的退火结果:siHOXA5A、siHOXA5B、siHOXA5C和siC发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸,退火后,电泳可见明亮条带,位于50～60bp处,与设计完全一致。2.重组表达载体鉴定结果:PCR结果显示,空pRNAT-U6.1扩增产物为150 bp,阳性克隆由于插入约60 bp的发卡DNA片段,故扩增产物约为210bp。所有3种针对HOXA5和1个无关对照重组转化克隆都得到阳性克隆,阳性重组子pRNAT-U6.1-siHOXA5A、pRNAT-U6.1-siHOXA5B、pRNAT-U6.1-siHOXA5C和pRNAT-U6.1-siC插入片段测序的结果,与设计序列比较结果完全一致。3.RT-PCR方法测定结果显示:在转染pRNAT-U6.1-siHOXA5A、pRNAT-U6.1-siHOXA5B、pRNAT-U6.1-siHOXA5C的实验组EC9706细胞中,HOXA5mRNA的表达水平明显低于3个对照组,且pRNAT-U6.1-siHOXA5B对HOXA5 mRNA的抑制作用强于pRNAT-U6.1-siHOXA5A和pRNAT-U6.1-siHOXA5C,几乎完全抑制了HOXA5 mRNA的表达,而3个对照组（无关siRNA对照组、空载体对照组和空白对照组）EC9706细胞中都存在较高水平HOXA5 mRNA表达。4.EC9706细胞经HOXA5B siRNA处理24～96 h后,光镜下可见细胞呈现一定程度的增殖抑制,细胞密度低于空白对照组、无关siRNA转染组（P＜0.05）。5.FCM检测显示:转染EC9706细胞48 h后,siRNA转染组能明显促使细胞周期静止在G0/G1期,其在G0/G1期的比率高达77.3%±5.4%,与空白对照组及无关siRNA对照组G0/G1期的细胞数（分别为59.5%±4.9%和59.8%±5.2%）相比差异有统计学意义（F=11.65,P＜0.05）。6.FCM检测结果显示:与空白对照组（5.77%±1.31%）和无关siRNA转染细胞组（5.39%±1.23%）相比较,HOXA5B siRNA转染组转染48 h后细胞凋亡率明显增加（35.57%±2.40%）（F=300.20,P＜0.05）。7.HOXA5 siRNA作用于EC9706细胞48 h,可导致明显的凋亡条带出现,在琼脂糖凝胶电泳上呈现有一定间隔的梯状条带,而空白对照组、无关siRNA转染组仅在点样孔处出现基因组条带。8.RT-PCR检测显示siRNA转染组HOXA5 mRNA水平为0.324±0.017;无关siRNA对照组为0.842±0.088;空白对照组为0.819±0.076,siRNA转染组EC9706细胞HOXA5 mRNA表达水平明显低于2个对照组（F=55.82,P＜0.05）。9.siRNA转染组EC9706细胞的HOXA5蛋白印迹最弱,而无关siRNA对照组和空白对照组EC9706细胞中都存在有明显的HOXA5蛋白印迹。第三部分HOXA5B siRNA转染对食管鳞癌EC9706细胞中CyclinD1、Livin和Smac表达的影响方法1.在37℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养转染pRNAT-U6.1-siHOXA5B的食管癌EC9706细胞（siRNA转染组）、无关siRNA转染对照组和未转染（空白对照组）的食管癌EC9706细胞。2.分别制备细胞爬片和提取3组细胞的总RNA。3.应用细胞免疫化学、原位杂交和RT-PCR方法检测3组EC9706细胞中CyclinD1、Livin、Smac蛋白和mRNA的表达情况。结果1.空白对照组及无关siRNA对照组cyclinD1 mRNA和蛋白阳性细胞数量较多,呈高水平表达,而siRNA转染组的细胞染色较深,阳性细胞数少,呈低水平表达,3组间比较差异有统计学意义（F值分别为296.38、257.74,P均＜0.05）。2.RT-PCR结果显示:空白对照组及无关siRNA对照组食管癌EC9706细胞中Livin mRNA呈高表达,siRNA转染组呈低表达,3组间比较差异有统计学意义（F=1 551.74,P＜0.05）。Smac mRNA在空白对照组及无关siRNA对照组呈低表达,而在siRNA转染组呈高表达,3组间比较差异有统计学意义（F=1 695.56,P＜0.05）。3.Livin和Smac蛋白棕黄色阳性颗粒信号定位于细胞质中。免疫细胞化学检测结果显示:空白对照组及无关siRNA对照组Livin蛋白阳性细胞数量较多,呈高水平表达,而siRNA转染组阳性细胞数少,呈低水平表达,3组间比较差异有统计学意义（F=4 452.99,P＜0.05）。而Smac蛋白在空白对照组及无关siRNA对照组呈低表达,而siRNA转染组呈高表达,3组间比较差异有统计学意义（F=283.97,P＜0.05）。第四部分沉默HOXA5基因对裸鼠移植瘤生长的抑制作用方法1.分别将转染pRNAT-U6.1-siHOXA5B的EC9706细胞（siRNA转染组）、无关siRNA转染对照组和未转染（空白对照组）的EC9706细胞注入裸鼠背部肩胛旁区皮下（0.2 mL/只,1×10⁷个细胞/mL）进行荷瘤实验。2.每隔3 d测量肿瘤的长径（l）和短径（s）,根据公式V=l×s²×0.5来计算肿瘤的体积,绘制肿瘤的生长曲线并计算成瘤率。3.接种肿瘤细胞5周后,颈椎脱臼处死,分离肿块,用游标卡尺测量裸鼠肿瘤体积后,切除部分新鲜标本冷冻,以备PCR实验所用;剩余肿瘤组织用40g/L多聚甲醛固定,石蜡包埋,4μm连续切片,备HE染色、免疫组化和原位杂交用。4.分别应用RT-PCR、原位杂交方法和免疫组化方法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA5、CyclinD1、CyclinB1、Livin、Smac mRNA和蛋白的表达情况。结果1.转染pRNAT-U6.1-siHOXA5B组裸鼠移植瘤体生长缓慢,瘤体体积明显小于空白对照组和无关siRNA转染的EC9706细胞裸鼠,组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。2.3组裸鼠移植瘤组织HE染色后,光镜检查发现,瘤细胞多为圆形或多角形上皮样细胞,细胞排列紧密,呈明显异型性,部分肿瘤细胞核仁清晰可见,病理性核分裂像可见。坏死灶依空白对照组、无关siRNA对照组、siRNA转染组的顺序,其数量和大小逐渐增大。3.siRNA转染组裸鼠移植瘤组织均未见到HOXA5 mRNA和蛋白阳性表达,而空白对照组、无关siRNA对照组均可见到HOXA5 mRNA和蛋白阳性表达,3组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR结果与之一致。4.siRNA转染组裸鼠移植瘤组织中CyclinD1和CyclinB1 mRNA和蛋白的阳性表达较低,而空白对照组、无关siRNA对照组CyclinD1和CyclinB1 mRNA和蛋白的阳性表达均明显升高,3组间2种蛋白和mRNA的阳性表达差异均有统计学意义（P＜0.05）。5.空白对照组及无关siRNA对照组裸鼠肿瘤组织均可见到Livin蛋白阳性染色,而siRNA转染组仅见到少量Livin蛋白阳性染色;在siRNA转染组中LivinmRNA的相对含量低于空白对照组及无关siRNA对照组。3组间Livin蛋白和mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。6.空白对照组及无关siRNA对照组裸鼠移植瘤组织中均可见到少量Smac蛋白阳性染色,而siRNA转染组可见较多的Smac蛋白阳性染色;在siRNA转染组中Smac mRNA的相对含量高于空白对照组及无关siRNA对照组,3组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）本研究首次系统地观察了HOXA5基因在食管鳞癌、癌旁不典型增生及正常食管黏膜组织中mRNA和蛋白的表达规律;探讨了食管鳞癌发生发展中CyclinD1、CyclinB1、Livin及Smac蛋白和mRNA的表达及它们与HOXA5表达的关系;从体内、外两个角度观察了以HOXA5作为靶点对食管癌进行基因治疗的可行性,得出以下结论:1.食管鳞癌组织中HOXA5蛋白和mRNA呈高表达,在癌旁不典型增生组织中亦呈现高表达趋势,提示HOXA5的表达异常是食管癌发生发展中的一个早期事件,其在食管鳞癌的演进过程中具有重要的作用。2.CyclinD1、CyclinB1、Livin蛋白和mRNA在食管鳞癌组织中呈高表达,Smac蛋白和mRNA在食管不典型增生组织中呈高表达。3.食管鳞癌组织中HOXA5蛋白的表达和CyclinB1,CyclinD1,Livin蛋白的表达呈正相关,与Smac蛋白的表达呈负相关。4.成功构建了3个针对HOXA5基因的siRNA表达载体,并筛选出最强的干扰表达载体pRNAT-U6.1-siHOXA5B。沉默HOXA5的表达可使EC9706细胞的增殖能力降低,促使其静止在G0/G1期的细胞增多,且细胞凋亡增加。5.HOXA5B siRNA表达载体转染EC9706细胞后,细胞中CyclinD1、Livin蛋白和mRNA表达降低,而Smac蛋白和mRNA表达升高。6.体外实验及体内移植瘤实验均显示:下调HOXA5的表达能直接导致CyclinD1、Livin的表达水平的下调和Smac表达的上调。7.HOXA5基因可望成为食管癌靶向治疗的一个新靶点。