【摘 要】
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世界范围内的霉菌毒素污染会对人类和动物的健康、世界经济和国际贸易产生重大影响。黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）等霉菌毒素后被人和动物摄入会引发各种疾病,且花生中黄曲霉毒素的出口损失将超过4.5亿美元。相比于物理法和化学法,生物酶法降解毒素具有绿色环保、成本低廉等特点。由于被污染原料中通常有多种霉菌毒素同时存在,它们之间的协同作用会加强致毒作用,因此探索并开发能
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世界范围内的霉菌毒素污染会对人类和动物的健康、世界经济和国际贸易产生重大影响。黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）等霉菌毒素后被人和动物摄入会引发各种疾病,且花生中黄曲霉毒素的出口损失将超过4.5亿美元。相比于物理法和化学法,生物酶法降解毒素具有绿色环保、成本低廉等特点。由于被污染原料中通常有多种霉菌毒素同时存在,它们之间的协同作用会加强致毒作用,因此探索并开发能够同时降解多种霉菌毒素的降解酶具有重要的研究意义。本研究实现了两种分别来源于黄孢原毛平革菌（P.chrysosporium）、乳白耙菌（I.lacteus CD2）的锰过氧化物酶（Mnp）在毕赤酵母GS115中的外分泌表达纯化,利用Mnp的发酵上清液对AFB1、ZEN、DON进行了降解效果的研究和优化,并进行了饲料样品中的霉菌毒素降解实验。具体研究如下:1、本研究进行了两种来源的Mnp在食品级毕赤酵母中的表达、纯化,并发现Mnp重组质粒在毕赤酵母表达过程中发生了N-糖基化。在将Mnp重组质粒导入毕赤酵母后构建了重组菌GS115（pPIC9K-PhcMnp）和GS115（pPIC9K-Irl Mnp）。利用重组菌诱导表达得到的发酵上清液降解霉菌毒素时,发现它们具有同时降解AFB1、ZEN、DON的活性。GS115（pPIC9K-Phcmnp）所有转化子的发酵上清液对AFB1、ZEN、DON的最高降解率分别为76.56%、70.78%、48.93%,GS115（pPIC9K-Irlmnp）所有转化子的发酵上清液对AFB1、ZEN、DON的最高降解率分别为46.72%、45.13%、40.54%。2、对重组菌GS115（pPIC9K-PhcMnp）和GS115（pPIC9K-Irl Mnp）的诱导表达条件进行了优化,得出毕赤酵母诱导表达Mnp的最佳条件为:培养基p H为5.0～5.5,含0.5 mmol/L～1.0 mmol/L hemin,0.5 mmol/L～1.0 mmol/L Mn SO4,28℃～30℃下每24 h添加1.0%～1.5%的甲醇诱导酵母产酶。3、对重组菌GS115（pPIC9K-PhcMnp）和GS115（pPIC9K-Irl Mnp）发酵液降解AFB1、ZEN、DON进行了优化。优化后PhcMnp发酵液对AFB1、ZEN和DON降解率分别为85.31±3.90%、80.92±1.80%、59.39±0.80%,比未优化时分别提高了11.42%、14.32%、21.37%。Irl Mnp发酵液优化后对AFB1、ZEN和DON降解率分别为57.40±2.50%、56.04±0.90%、52.62±1.10%,分别提高了22.86%、24.17%、29.80%。4、为提高重组菌GS115（pPIC9K-PhcMnp）发酵上清液在饲料中降解时的安全性,采用葡萄糖和葡萄糖氧化酶反应代替过氧化氢。重组菌发酵上清液对饲料中不同浓度的AFB1的降解率均超过70%,对不同浓度的ZEN的降解率几乎均超过60%,当DON浓度为2000μg/kg时,重组菌GS115（pPIC9K-PhcMnp）发酵上清液对其降解率在50%左右。因此,PhcMnp在实际饲料的毒素降解中应用良好。
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