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目的CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)是可以影响细胞增殖、分化和代谢的重要转录因子,在肝细胞肝癌中高表达并且其高表达预示了肝癌患者的预后不良。本课题旨在研究组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs)在肝癌细胞中上调C/EBPα的具体信号通路。方法(1)C/EBPα高表达的Huh7肝癌细胞以及Hep3B肝癌细胞中,使用HDAC抑制剂(TSA、SAHA和PXD101)处理或溶剂对照处理,研究HDAC对C/EBPα表达量的影响。采用荧光实时定量聚合酶链式反应和免疫印迹实验检测C/EBPα表达量的变化。(2)一方面,在Huh7肝癌细胞中转染构建了含有了C/EBPα5’UTR端的荧光素酶表达载体,并用HDAC抑制剂(TSA)处理已转染质粒的Huh7肝癌细胞,采用荧光素酶实验检测荧光素酶强度,以确定HDAC是否作用在C/EBPα5’UTR端。另一方面,在Huh7肝癌细胞中转染构建了C/EBPα3’UTR端的荧光素酶表达载体,并用HDAC抑制剂(TSA、SAHA)分别处理已转染了质粒的Huh7肝癌细胞观察荧光素酶的强度与溶剂对照组相比较,以检测HDAC抑制剂是否作用在C/EBPα的3’UTR端上。(3)通过查阅整理文献以及使用生物信息软件Targetscan和miRwalk查找出可能作用在C/EBPα3’UTR端上的miRNA。然后用HDAC抑制剂(SAHA)处理Huh7肝癌细胞后,观察miRNA是否受HDAC抑制剂调控,同时观察C/EBPα的表达量的变化是否与miRNA的变化幅度一致。以Huh7肝癌细胞系为研究模型,结果目的在于验证HDAC基因序列的siRNA导入之后,是否会对细胞中HDAC miRNA的表达产生影响,以确定HDAC是否调控上述miRNA的表达。(4)在Huh7肝癌细胞里面转染进miR-124抑制剂或miR-25抑制剂以及阴性对照,再加入HDAC抑制剂或溶剂对照组观察C/EBPα的表达量变化,以确定miRNA是否能影响HDAC上调C/EBPα表达的功能。在Huh7肝癌细胞中分别转染进构建突变了miR-124结合位点的C/EBPα3’UTR的双报告系统的荧光素酶质粒,或突变了miR-25结合位点的C/EBPα3’UTR的双报告系统的荧光素酶质粒以及miR-124和miR-25结合位点双突变的双报告系统的荧光素酶质粒。质粒转染后加入HDAC抑制剂观察荧光素酶的强度,以确定HDAC抑制剂是否通过影响miRNA来间接影响了C/EBPα的表达量。(5)在Huh7肝癌细胞中转染进miR-124和miR-25的模拟物以及对照NC miRNA,来观察miR-124和miR-25是否可以影响肝癌细胞的生长增殖。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂盒观察细胞的增殖活性并且采用免疫印迹法观察C/EBPα的表达量。(6)利用课题组前期已经报道过的应用免疫组化的方法检测得到的肝癌组织中HDAC1,HDAC2,C/EBPα的蛋白表达情况,采用Chi-square分析法分析C/EBPα与HDAC1,HDAC2的相关性。(7)使用21对肝癌组织以及癌旁正常肝组织中的总RNA,用荧光实时定量聚合酶链式反应测定miR-124和miR-25的含量,比较肝癌组织和癌旁正常肝组织的表达差别。结果(1)实时定量链式聚合酶反应以及免疫印迹法结果显示,在Hep3B和Huh7肝癌细胞中给予HDAC抑制剂处理后,C/EBPα的表达量减少并呈剂量反应关系(P<0.05)。(2)双荧光素酶报告系统实验结果显示,在转染了不同长度片段的C/EBPα的5’UTR启动子序列的Huh7肝癌细胞中,荧光素酶活性经HDAC抑制剂处理后与对照组相比得到提升,这提示HDAC抑制剂反而促进了C/EBPα的转录活性。但是在转染了C/EBPα3’UTR的Huh7肝癌细胞中,使用HDAC抑制剂(TSA、SAHA)处理的组别与对照组相比荧光素酶强度下降(P<0.01),这与C/EBPαmRNA的下降是一致的。(3)通过荧光实时定量链式聚合酶反应发现,(1)在HDAC抑制剂处理了Huh7肝癌细胞后,miR-124和miR-25都呈现了含量上升(P<0.05)并且呈现时间依赖关系。而miR-124、miR-25的含量上升之后,C/EBPαmRNA的含量才开始下降,并且其下降的趋势与miR-124和miR-25上升的幅度具有一致性。而miR-381等miRNA在HDAC抑制剂处理后含量变化与C/EBPα变化幅度并没有呈现出时间依赖的趋势。(2)在沉默了HDAC1和HDAC2的Huh7肝癌细胞中,miR-124和miR-25都出现了含量上升(P<0.01)而且C/EBPαmRNA表达量下降(P<0.01)。(4)通过荧光实时定量聚合酶链式反应发现:(1)首先在Huh7肝癌细胞中转染miR-124抑制剂后,C/EBPαmRNA含量上升(P<0.05)。其次,在转染了miR-124抑制剂的Huh7肝癌细胞中进一步给予HDAC抑制剂的处理,C/EBPα的mRNA含量却没有呈现下降的趋势。(2)miR-25抑制剂也促进了Huh7肝癌细胞中C/EBPαmRNA含量上升(P<0.05),但逆转了HDAC抑制剂对C/EBPαmRNA的降低作用。另一方面,双荧光素酶报告系统实验结果显示,(1)在转染进miR-124结合位点被突变质粒的Huh7肝癌细胞中,再加入HDAC抑制剂处理。与野生型对照组比较,miR-124结合位点的突变逆转了HDAC抑制剂对C/EBPα3’UTR的作用。(2)同样地,miR-25结合位点被单独突变,或者miR-124结合位点和miR-25结合位点被双突变,都可以逆转HDAC抑制剂对C/EBPα3’UTR的作用。(5)在Huh7肝癌细胞中给予HDAC抑制剂处理,细胞增殖率下降。相应的,转染进miR-25模拟物或miR-124模拟物也可以导致细胞增殖率下降。同时在转染进miR-124模拟物和miR-25模拟物的Huh7肝癌细胞中,C/EBPα的蛋白表达量与对照组和NC组相比有明显下降。(6)肝癌病人肝癌组织的免疫组化的结果显示,肝癌组织中C/EBPα蛋白与HDAC1和HDAC2的蛋白翻译正向相关性(P<0.05)。(7)通过荧光实时定量链式聚合酶反应针对21对肝癌组织和癌旁组织的相关基因的表达研究发现:(1)癌旁正常肝脏组织的miR-124含量高于癌症组织(P=0.03)。(2)癌旁正常肝脏组织的miR-25含量高于癌症组织(P=0.01)。结论:(1)在Huh7肝癌细胞中HDAC抑制剂或siRNA可以下调C/EBPα的表达且呈剂量反应关系。(2)HDAC非直接作用在C/EBPα5’UTR启动子上,从而影响C/EBPα的表达。(3)HDAC抑制剂可以通过上调miR-124和miR-25的含量,而miR-124和miR-25可以作用在C/EBPα3’UTR上,间接使得C/EBPαmRNA稳定性下降而表达降低。(4)miR-124,miR-25和HDAC抑制剂都可以使肝癌细胞的细胞增殖活性下降。