论文部分内容阅读
第一部分体外诱导人成体骨髓间充质干细胞恶性转化目的：通过体外诱导的方法观察人骨髓间充质干细胞(MSCs)体外恶性转化的可能。方法：培养成体MSCs,通过GM-CSF和IL-4诱导MSCs一个月以上,形成转化后的骨髓间充质干细胞(transformed mesenchymal cells, TMCs)。观察TMCs的形态,测定TMCs和MSCs的生长曲线、细胞周期。流式细胞仪检测TMCs和MSCs的表面标志。并用western blot法检测TMCs和MSCs端粒酶和c-myc的含量。结果：用GM-CSF和IL-4诱导后6-8w, MSCs有部分细胞转化成TMCs,其形态具备了恶性肿瘤细胞的特点。流式细胞技术检测MSCs与TMCs表面标记物,发现TMCs CD13和CD105的阳性表达低于MSCs,而CD133和VEGFR2的阳性表达高于MSCs。TMCs生长速度比MSCs’快,其S期细胞含量为41.1%,较MSCs (9.67%)明显增加,表明TMCs较MSCs有更强的增殖能力。Western blot检测发现TMCs中端粒酶的含量是MSCs的16.7倍(t=15.00,p=0.0001); TMCs c-myc的含量比MSCs增加了172.2%(t=10.58, P=0.0005)。结论：MSCs体外培养时在GM-CSF和IL-4作用下可以发生恶性转化。第二部分转化后骨髓间充质干细胞成瘤的体内实验目的：通过动物实验检测转化后的骨髓间充质干细胞(TMCs)能否在动物体内形成肿瘤,从而验证MSCs发生了恶性转化。方法：经尾静脉注射实验：45只NOD/SCID小鼠分3组,每组15只,分别为TMCs组,MSCs对照组和空白对照组。实验组和MSCs对照组分别将2.5×105 cells/ml的细胞悬液200μ1经尾静脉注射至NOD/SCID小鼠体内,空白组注射200μl PBS。在第3、7、14、21和25d每组分别处死裸小鼠各3只。取出肺脏,称重,并计数转移结节。将肺脏标本切片行HE染色和免疫组化检查。经皮下注射实验：将18只6周龄雄性BALB/C-nu裸小鼠分为TMCs组、MSCs对照组和空白对照组,每组6只。实验组和MSCs对照组分别将2.5×105 cells/ml的细胞悬液200μ1注射至6周龄BALB/C裸小鼠前臂内侧皮下,空白对照组注射200μl PBS。第25d处死小鼠,取出皮下肿瘤病灶测量大小并称重。肿瘤标本切片行HE染色和免疫组化检查。结果：尾静脉注射时发现第7d TMCs组开始出现肺部转移结节,第14d开始所有裸鼠均发生肺部转移。MSCs对照组和空白对照组均没有转移结节形成。TMCs和MSCs两组裸鼠在3、7、14d时鼠肺湿重差别没有统计学意义。而21d、25d时TMCs组鼠肺湿重明显增加。HE染色肿瘤细胞排列紊乱,核大小、形状和染色不一,并可见多核、异型核等,具备了恶性肿瘤细胞的特点。免疫组化结果肺部转移灶中鼠肺细胞的CD133阳性率明显增加。皮下注射组所有TMCs组12～16d均在裸鼠皮下形成肿瘤,体积为3.02±0.83cm3,重量1.37±0.16g；而对照组均未形成肿瘤结节。皮下肿瘤组织免疫组化结果显示VIM(+),DES(+),SMA(+),CD133(+), CD34(+),S100(+), NSE(-),PA-CK(-),EMA(-),DFAP(-),提示肿瘤可能为横纹肌来源恶性肿瘤,同时显示TMCs具有干细胞特性,能向不同种类细胞分化。结论：TMCs为恶性肿瘤细胞,无论通过尾静脉注射或皮下种植均能在裸鼠体内形成肿瘤。MSCs不能在裸鼠体内形成肿瘤。第三部分siRNA抑制hTERT基因表达对转化后骨髓间充质干细胞的影响目的：探讨小干扰RNA (siRNA)抑制端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)表达对转化后骨髓间充质干细胞(TMCs)增殖和在动物体内成瘤能力的影响。方法：构建针对人hTERT的siRNA,通过脂质体转染的方法将hTERT-siRNA转染TMCs。实验分为3个浓度组,分别为50nmol/L, 100nmol/L和200nmol/L,设阴性对照组和空白对照组。用MTT法和流式细胞仪检测siRNA对TMCs生长增殖和凋亡的影响。用western blot检测各浓度组TMCs的端粒酶蛋白的含量。RT-PCR各浓度组hTERT mRNA的含量,并用TRAP-ELISA法检测各浓度组TMCs端粒酶的活性。通过BALA/C裸鼠检测siRNA转染后各组TMCs在动物体内成瘤能力的变化。结果：通过western blot,我们发现不同浓度的hTERT-siRNA组TMCs的端粒酶蛋白含量逐渐减少,与siRNA的浓度呈负相关,50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L组分别下降了46.2%,69.5%和91.5%; MTT法检测3个浓度组hTERT-siRNA对细胞的生长抑制率分别为2.74%、7.26%和10.23%。其中50nmol/L组和对照组之间差别没有统计学意义,而100nmol/L组和200nmol/L组与阴性对照组之间差别有统计学意义。流式细胞仪检测50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA转染组的TMCs凋亡率分别为：5.12%,6.67%和8.04%,各组和对照组相比差别均有统计学意义。RT-PCR检测结果显示50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L hTERT-siRNA转染组hTERT基因分别下降了19.2%,47.2%,86.4%。TRAP-ELISA法检查发现,不同浓度的hTERT-siRNA对TMCs的端粒酶活性都产生抑制作用,3组分别下降了11.0%,42.9%,86.2%。100nmol/L组和对照组TMCs在裸鼠皮下形成肿瘤的时间相似,分别为14.8d和14.2d; 200nmol/L组成瘤时间较晚,为17.3d。对照组形成的皮下肿瘤体积和重量分别为2.56cm3和1.30g,而100nmol/L和200nmol/L组肿瘤体积分别为0.64cm3和0.31cm3；重量分别为0.78g和0.58g,与对照组间差别均有统计学意义。结论：siRNA可以下调hTERT基因的表达,减少TMCs细胞内端粒酶的含量,也降低了端粒酶的活性,从而增加了TMCs的凋亡、抑制了TMCs的生长,并降低了TMCs在裸鼠体内的成瘤能力。端粒酶在MSCs恶性转化的过程中可能起了重要的作用。