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目的胶原海绵是组织提取物胶原经冻干制成的海绵状轻质片。本研究旨在通过对胶原海绵进行化学改性,改善胶原海绵机械强度不足、降解过快、过高的凝血酶活性和过度溶胀造成负载药物或活性细胞因子快速释放等缺点,使其在化学组成、物理结构、分子结构和生物学功能等方面尽可能与细胞外基质相似。改性后的胶原海绵不仅具有良好的生物相容性、较高的孔隙率、适中的机械强度和细胞粘附生长的结合位点,而且可以通过包埋和释放活性因子为损伤修复提供一个传输和诱导性环境。制备出一种理想的深度创伤敷料或组织修复支架,调节组织生长的环境,加速组织修复再生的血管化进程。方法采用酶解法从猪皮中提取胶原,通过HAc溶解制成均匀的胶原凝胶,SDS-PAGE鉴定其组成成分。-80℃冷冻保存,冷冻干燥制成胶原海绵。再分别采用零长度EDC/NHS交联一步法和EDC/NHS交联与肝素复合同步法对胶原海绵改性加工,主要从交联度、变性温度、焓、红外光谱峰值、微观形貌、吸水力、酶解稳定性、机械强度、细胞复合及增殖实验、复合bFGF的缓释周期和活性保持情况几方面比较分析未经处理的对照组、EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组胶原海绵在理化性能、生物性能和对复合bFGF的缓释和活性保持作用几方面的差异。初步考察上述两种改性方法的优越性。结果胶原SDS–PAGE图谱表明提取纯度较高,主要是Ⅰ型胶原,无Ⅲ型胶原存在。甲苯胺蓝分光光度法测定肝素均匀复合在胶原海绵表面,复合量为30mg/g。红外光谱峰值的改变说明了胶原分子间或胶原与肝素分子间或胶原分子内酰胺间的形成,部分–NH2转变为–NH,–COOH参与了交联反应,而且活化的肝素分子通过–COOH与–NH2共价键结合牢固结合胶原海绵表面,经改性处理后任意的α螺旋结构没有减少,反而在交联作用和肝素的共价结合下,肽链结合更牢固,螺旋结构的稳定性增强,体现在改性两组胶原海绵吸收峰的差异。TNBS比色法测定EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组自由氨基数大幅度减少,从对照组381(±7.36)nmol/mg分别降低到230(±5.53)nmol/mg和203(±16.27)nmol/mg,且EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin两组之间存在显著性差异(One way, ANOVA; p=0.023),反映两种改性方法在增强材料交联度方面的差异。改性胶原基质的湿热稳定性大大增强,变性温度从27.5℃分别升高到71℃和65℃。在两组之间交联度和成分差异的基础上,改性胶原海绵吸水力的增强程度也有不同,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别是36.85(±2.17)和32.41(±1.78)mg/mg,两组之间有显著性差异(One way, ANOVA; p=0.043)。另一方面,在干燥湿润状态下,胶原海绵形态稳定性增强。酶解稳定性方面也得到提高,经过9d的酶解后,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组剩余海绵基质分别是原始质量的81.4%和84.7%,而对照组在1.5-2h内几乎完全降解,EDC/NHS交联处理(One way, ANOVA; p<0.0001)和酶作用时间(One way ANOVA; p<0.0001)对胶原海绵基质降解有显著性差异,酶解后海绵微观结构和表面形态同样证实了这一结论。在机械性能的对比研究中,在干燥状态下,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的最大载荷、断裂应力和弹性模量均显著增强,且存在差异性;在湿润状态下,两组最大载荷、断裂应力和断裂应变大幅度降低,但弹性模量均高于对照组。在HUVECs复合和共培养研究中,对照组细胞存活良好,但与后者相比,增殖速度较慢。而细胞在EDC/NHS组海绵支架上,细胞存活良好,沿微孔孔壁粘附伸展良好,增殖速度高于对照组。EDC/NHS-Heparin组,细胞不仅能存活粘附生长,而且在相同的时间内增殖速度明显高于另外两组,细胞沿孔壁生长,分布较均匀,大部分细胞融合且沿着海绵孔壁形成孔状结构,部分细胞向孔中央迁移。同时,共培养早期,对照组胶原海绵在内皮细胞分泌的蛋白酶作用下部分降解,三维网状结构彻底塌陷,无孔状结构;而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组在长时间共培养期间,三维网状结构均保持良好,无任何塌陷。在进一步的bFGF复合、缓释和bFGF活性保持方面的评价中,EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组的释放时间明显延长,且复合bFGF的EDC/NHS-Heparin组海绵在第1d内的突释量18%明显低于EDC/NHS组19.5%和对照组30.9%,缓释周期较长,在37d时释放量约94%。负载bFGF的海绵基质活性检测表明胶原海绵负载bFGF有利于生长因子的缓释,经MTT检测,三组海绵载体复合bFGF,对bFGF的活性保持作用有明显差异。对照组在57d时仅21.9%具有活性,而EDC/NHS组和EDC/NHS-Heparin组分别约有48.4%和58.6%保持活性。结论改性处理使胶原海绵交联度、热变稳定性、吸水力和酶解稳定性大大增强,孔径变大,形态稳定性和机械强度显著提高。相对EDC/NHS组,EDC/NHS- Heparin组交联度和酶解稳定性均有所提高,而变性温度和焓有少许降低,吸水力减小,且干燥/湿润状态下形态稳定性避免了胶原海绵接触体液后形变过大带来的不便和负载的生长因子或药物快速释放的缺点。EDC/NHS-Heparin组不仅能蓄积充足的营养液促进细胞快速增殖迁移,三维网状结构保持良好,有利于长期培养过程中氧与营养成分的传输和代谢物的排出。HUVECs接种到EDC/NHS- Heparin组海绵支架上,快速黏附伸展,生长良好,且在短时间内增殖迅速,融合并向海绵微孔中央迁移,明显高于EDC/NHS组和对照组。体外评价表明改性海绵促内皮细胞增殖,预示其具备加速组织血管化速度的能力,创伤修复速度将会明显高于另外两组,且在肝素的作用下,修复处皮肤疤痕会比较小,且光滑。复合微量bFGF的释放和活性检测试验表明,与对照组相比,改性两组降低了突释量,延长释放周期,活性保持良好。说明改性的胶原海绵有利于bFGF缓释和活性保持,且EDC/NHS-Heparin组优于EDC/NHS组。总之,EDC/NHS交联和肝素复合同步法不仅简化通常两步法繁琐的操作,而且在不明显降低活性的情况下,对改善材料理化性能、生物性能和缓释bFGF方面有显著作用。