论文部分内容阅读
融合蛋白GGH是由两个人胰高血糖素样肽-1突变体和人血清白蛋白HSA融合而成的重组蛋白，与单体GLP-1相比，GGH不仅可以促进β细胞的增殖、胰岛素的分泌，还大大的提高了体内的半衰期，但其活性并没有达到预期，主要原因可能是氮末端的不完整，针对这一点，本文对GGH的氮端添加氨基酸延长修饰，设计出5种GGH的氮端延长类似物，成功构建了表达5种类似物的基因工程菌，并分离纯化得到五个类似物，进行了活性的筛选和鉴定，主要结论如下：（1）对母体融合蛋白GGH进行了5种方法的延长修饰，即DAH-GGH、MSY-GGH、TFT-GGH、A-GGH和G-GGH，针对延长修饰的思路，首先设计出含有延长氨基酸核酸序列的引物，PCR扩增得到类似物的基因，构建了GGH类似物的重组表达载体，转化子经过菌液PCR、双酶切和测序验证后，以P.pastoris GS115为宿主成功的构建了GGH氮端延长修饰的5个类似物的表达菌株。（2）融合蛋白GGH类似物的毕赤酵母表达菌株发酵表达条件是：120mL/三角瓶体积的装液量，pH6.0、30℃、200r/min、2%的甲醇诱导浓度、诱导时间72h，五株菌株的蛋白表达量为150-160mg/L。（3）融合蛋白GGH类似物分离纯化的步骤是：冷冻离心：4℃、8000r/min冷冻离心10min，收集上清，超滤浓缩20倍，调节电导为13.0mS/cm。依次经过Blue Sepharose6Fast Flow层析、Phenyl Sepharose6Fast Flow层析、Q Sepharose Fast Flow层析和Sephadex G-25凝胶层得到纯度为98.0%GGH的类似物，SDSPAGE考马斯亮蓝染色和银染证实了纯化蛋白的纯度，纯化过程总回收率达到33.3%。（4）体外活性结果显示TFT-GGH，A-GGH与G-GGH均可以显著的促进cAMP的生成，且A-GGH与G-GGH的体外活性比母体蛋白GGH提高了10倍。小鼠体内糖耐量实验结果表明A-GGH与G-GGH还可以显著控制KM小鼠口服葡萄糖后血糖的增幅，而且类似物A-GGH在给药24h后仍可以显著的发挥控制血糖增高的效果。（5）对体内外活性较高的类似物A-GGH进行质谱法分子量测定，结果发现测定出峰值在6.8104和7.15104m/z，发现它产生了一个新的出峰7.15104m/z，此峰分子量接近其理论分子量（72kD），分子量测定结果证明类似物A-GGH的稳定性有所提高。