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文昌鱼(amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型,是现存的与脊椎动物祖先最接近的无脊椎动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的重要模式动物。文昌鱼基因的序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基因组学研究和发育同源性分析。本文从文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中克隆了在与脊椎动物肝脏特异性表达的纤溶酶原(Plg)基因,并对其结构、进化、表达和功能进行了研究,同时深入研究了也在脊椎动物肝脏特异性表达的胰岛素样生长因子(IGF)的功能,为脊椎动物肝脏的起源提供了更多证据。我们在文昌鱼中克隆了一个全长1949 bp的Plg cDNA,其开放阅读框长度为1290 bp,5’非翻译区长123 bp,3’非翻译区长536 bp,该cDNA包含的最长开放阅读框编码一个430个氨基酸的蛋白,分子量大约为48 kDa,将其命名为BbPlgl。运用信号肽分析预测软件Signal IP 3.0 server进行信号肽预测揭示其氨基端16个氨基酸为信号肽。通过经NetNGlyc 1.0 Server糖基化预测,在32位氨基酸处存在一个潜在的糖基化位点,因此推测BbPlgl可能为一种糖蛋白。BLASTp搜索结果显示该蛋白的氨基端含有两个kringle结构域,羧基端为类丝氨酸蛋白酶结构域。两个kringle结构域K1和K2在氨基酸水平上存在51.9%的一致性,而且BbPlgl的K1和K2与已知纤溶酶原的K1分别存在43.0%-58.2%和41.8%-51.9%的一致性,与K2分别存在41.8%-51.9%和50.6%-60.9%的一致性,与K3分别存在49.4%-57.0%和51.9%-63.3%的一致性,与K4分别存在50.6%-55.7%和46.8%-55.7%的一致性,与K5分别存在50.6%-57.0%和44.3%-50.6%的一致性,说明BbPlgl的K1和K2可能是纤溶酶原K1-K5的原型。将BbPlgl的kringle结构域和类丝氨酸蛋白酶结构域分别与纤溶酶原-凝血酶原家族成员的相应结构域构建系统进化树,结果显示文昌鱼BbPlgl的K1与kringle结构域的groupⅠ聚簇,BbPlgl的K2与kringle结构域的groupⅡ聚簇,类丝氨酸蛋白酶结构域位于纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族(包括Plg, HGF, MSP, APOA)的基部,这些结果显示BbPlgl或许代表纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族的一种原型。构建BbPlgl的原核表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达。Western blotting结果显示该蛋白为重组表达蛋白。纯化的重组蛋白能够被人尿激酶所激活并对纤溶酶原的特异性发色底物S2251表现出8.7 mU/mg的酶活力。Northern blotting的结果显示BbPlgl的转录产物为单一条带,长度约为2000 bp。原位杂交显示BbPlgl转录本在肝盲囊和后肠中的表达量最高,在内柱、内柱下面的血管、鳃、卵巢有低水平的表达,而在肌肉、神经管和脊索和精巢中没有杂交信号。所有这些都表明,文昌鱼Plgl可能代表纤溶酶原-载脂蛋白A亚家族的一种原型,并且其表达具有组织特异性；同时,这也显示在Plg合成方面,文昌鱼的肝盲囊和脊椎动物的肝脏具有相似性,支持了文昌鱼肝盲囊和脊椎动物肝脏在功能上的相似性。为了更深入的探讨BbIGF功能和作用机制,进一步为研究原索动物的GH/IGF轴提供证据,本研究中将BbIGF基因中与脊椎动物IGF成熟肽对应的区域进行体外重组表达,构建BbIGF-MP的表达载体,转化大肠杆菌后诱导表达,纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。我们采用组织消化法成功分离培养了昆明小鼠的原代肌肉细胞,并借助RT-PCR对其进行了初步鉴定。以体外分离培养的小鼠原代肌肉细胞为模型,以脊椎动物(人)的重组IGF-I做为参照,主要为了解决以下问题：(1)鉴定文昌鱼BbIGF-MP是否像人IGF-I一样具有和肌肉细胞以及肌肉组织IGF-I受体粗提物的结合能力；(2)鉴定BbIGF-MP是否能像人IGF-I一样做为促分裂原,促进肌肉细胞的增殖；(3)鉴定BbIGF-MP和人IGF-I在肌肉细胞中是否激活相同的胞内信号传导通路来发挥作用。结合实验显示异硫氰酸荧光素(FITC)标记的重组蛋白BbIGF-MP能够像脊椎动物IGF-I一样和原代肌肉细胞结合,同时酶联免疫吸附实验确定了其能够与小鼠肌肉组织以及文昌鱼中的IGF受体粗提物结合。MTT分析显示在10μg/ml的时候文昌鱼BbIGF-MP即能够显著促进细胞增殖,并呈现浓度依赖性,说明其具有促有丝分裂的功能。Western blot结果显示文昌鱼BbIGF-MP与不同时期原代肌肉细胞孵育后,能像重组人IGF-I一样在不同程度上促进MAPK和Akt的磷酸化,说明其通过这两条信号通路发挥作用。以上的研究进一步证实了文昌鱼BbIGF是功能上更接近IGF的insulin/IGF杂合多肽,而且其能够以和脊椎动物IGF-I相似的机制发挥功能。在脊椎动物中,IGFs尽管可以在多种组织中表达但其主要的合成部位仍是肝脏。肝脏是多种激素的重要的靶器官,而文昌鱼的肝盲囊一直被认为是脊椎动物肝脏的前体。我们的研究结果显示文昌色BbIGF与IGFs功能及作用机制的一致性,同时BbIGF在文昌鱼肝盲囊和后肠表达最为丰富,这进一步支持了文昌鱼肝盲囊是脊椎动物肝脏同源器官的推论,将GH/IGF轴进化的源头向前推进到了原始的脊索动物,也为进一步研究原索动物的GH/IGF轴铺平了道路。