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牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是感染牛的一种重要的病原体,主要引起牛的呼吸道疾病,呈全球性分布且发病率高,给全世界养牛业造成重大的经济损失。支原体及其脂蛋白可诱导宿主细胞凋亡造成器官损伤,牛支原体P48蛋白在结构和功能上都比较保守,在感染与致病过程中扮演着重要的作用。为此对于P48蛋白诱导宿主细胞凋亡的具体机制有待进一步研究清楚。基于此,本研究开展以下研究工作:(1)研究牛支原体诱导EBL细胞凋亡。牛支原体感染EBL细胞,通过MTT法检测细胞增殖率;流式细胞技术检测牛支原体诱导EBL细胞的凋亡率;qRT-PCR检测凋亡基因的mRNA相对表达变化;Western blot鉴定Bax和Beclin-1蛋白表达水平。结果显示:当作用时间为72 h,牛支原体浓度在0.1、0.5?g/mL时对EBL细胞增殖的抑制作用不显著,在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有显著的抑制作用;凋亡基因mRNA表达在2 h、12 h没有明显的提高,在24 h、48 h、72 h时显著提高,同时凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达上调;流式细胞技术结果显示牛支原体诱导EBL细胞的凋亡率显著提高。结果表明,牛支原体促进EBL细胞凋亡。(2)研究P48蛋白胞外诱导EBL细胞凋亡。纯化P48蛋白诱导EBL细胞,通过DAPI染核法观察EBL细胞核形态变化,并按照研究工作(1)中的方法检测。结果显示:当作用时间为72 h,P48蛋白浓度在0.1、0.5?g/mL时对EBL细胞增殖的抑制不显著,在10μg/mL时,对EBL细胞增殖有显著的抑制作用;经蛋白诱导48 h、72 h时细胞核发生碎裂;凋亡标志基因mRNA在2 h、12 h的表达量没有明显提高,在24 h、48 h、72 h时有显著提高,凋亡相关蛋白Bax和Beclin-1的表达上调。流式细胞技术结果显示在72 h时P48蛋白诱导EBL细胞凋亡率显著提高。结果表明,P48蛋白胞外诱导EBL细胞凋亡。(3)研究P48蛋白胞内诱导EBL细胞凋亡。成功构建P48基因真核表达载体pEGFP-N1-P48和pcDNA3.1-P48并转染EBL细胞,按照(1)中检测方法。结果显示:当作用时间为24 h时细胞发生早期凋亡,48 h时细胞发生中期凋亡,72 h时细胞发生晚期凋亡;凋亡基因mRNA表达在24 h提高不显著,48 h、72 h时显著提高,同时凋亡蛋白Bax的表达上调。结果表明,P48蛋白胞内诱导EBL细胞发生凋亡。(4)研究4-PBA抑制内质网应激介导的P48蛋白诱导EBL细胞凋亡。4-PBA预处理EBL细胞3 h后与P48蛋白共孵育,按照(1)中方法检测。结果显示:当作用时间为24 h,4-PBA抑制剂浓度为10 mmol/L时EBL细胞的凋亡率提高不显著,凋亡基因和内质网应激标志基因的mRNA表达下调,同时Bax、Beclin-1和GRP78蛋白的表达下调或不表达。结果表明,4-PBA通过抑制内质网应激途径从而减少P48蛋白诱导的EBL细胞凋亡。