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目的:细胞凋亡和自噬是肿瘤细胞死亡的主要方式,PI3K/Akt/mTOR信号通路是调控细胞凋亡和自噬的重要信号通路。研究表明中药白头翁具有抗肿瘤作用,而白头翁皂苷B4是白头翁干燥根提取物中的主要有效成分之一。本实验的目的是研究白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞增殖的影响,观察对细胞凋亡和自噬的作用,并从PI3K/Akt/mTOR信号通路初步探究其可能的作用机制。方法:1、细胞培养:SMMC7721细胞复苏后,用90%DMEM、10%FBS、1%青霉素链霉素的培养液,置于5%CO2、37℃的培养箱中培养。2、细胞活力检测:白头翁皂苷B4处理SMMC7721细胞后,以CCK-8实验和细胞克隆形成实验检测白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞增殖能力的影响。3、细胞凋亡检测:白头翁皂苷B4处理SMMC7721细胞后,DAPI、Annexin V-FITC和PI荧光染色实验、Annexin V-FITC和PI双染后细胞流式术实验检测白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞凋亡的作用;以Western Blot实验检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表达情况。4、细胞自噬检测:白头翁皂苷B4处理SMMC7721细胞后,以透射电镜、吖啶橙染色、单丹磺酰戊二胺染色检测白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞自噬的作用;以Western Blot实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62蛋白的表达情况;应用自噬抑制剂氯喹后,以Western Blot实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62蛋白的表达情况。5、PI3K/Akt/mTOR信号通路检测:白头翁皂苷B4处理SMMC7721细胞后,以Western Blot实验检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白的表达情况。结果:1、CCK-8实验结果显示:在相同的作用时间下,随着白头翁皂苷B4浓度的升高,对SMMC721细胞增殖的抑制率逐渐上升,在相同的白头翁皂苷B4浓度下,随着作用时间的增加,对SMMC721细胞增殖的抑制率逐渐上升。白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞的抑制作用呈浓度和时间依赖性。2、细胞克隆形成实验结果显示:20、40、80μM白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,实验组中克隆形成数目剂量依赖性地减少。3、免疫荧光实验显示:80μM的白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,与对照组相比,实验组中细胞出现较多红色荧光标记的细胞核和绿色荧光标记的细胞膜。4、流式细胞术实验结果显示:80μM的白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,实验组中的细胞凋亡率为55.03±2.79%,对照组为2.33±0.29%（p<0.01）。5、Western Blot检测凋亡相关蛋白结果显示:20、40、80μM白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞后24 h后,与对照组相比,实验组中Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表达逐渐增高,Bcl-2蛋白表达逐渐降低。6、透射电镜结果显示:80μM的白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,实验组中出现双层膜结构的自噬泡,而对照组组中未发现。7、吖啶橙染色实验结果显示:80μM的白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,与对照组相比,实验组中出现大量红色荧光标记的自噬囊泡。8、单丹磺酰戊二胺染色实验结果显示:80μM的白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞24 h后,实验组中出现大量黄绿色荧光标记的自噬囊泡,对照组中未发现。9、Western Blot检测自噬相关蛋白结果显示:20、40、80μM白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞后24 h后,与对照组相比,实验组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达逐渐增高,p62蛋白表达逐渐降低。白头翁皂苷B4和氯喹联合应用处理SMMC7721细胞24 h后,氯喹抑制了白头翁皂苷B4对SMMC7721细胞的自噬作用。10、Western Blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白结果显示:20、40、80μM白头翁皂苷B4处理SMMC721细胞后24 h后,与对照组相比,实验组中p-Akt、p-mTOR蛋白表达逐渐降低,Akt、mTOR蛋白表达无明显变化,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达逐渐降低。结论:1、白头翁皂苷B4抑制SMMC7721细胞的增殖,抑制作用呈浓度和时间依赖性。2、白头翁皂苷B4通过上调Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达和下调Bcl-2蛋白的表达诱导SMMC7721细胞凋亡。3、白头翁皂苷B4通过上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白的表达和下调p62蛋白的表达诱导SMMC7721细胞自噬。4、白头翁皂苷B4通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白的表达诱导SMMC7721细胞凋亡和自噬。