通络止痛方是笔者导师凭借多年治疗膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)的经验总结而成的外用方,并进行了一系列临床及基础研究。通络止痛外治法已证实在临床试验中可以有效减轻KOA患者疼痛并改善膝关节功能;在经典hulth造模的大鼠KOA实验中发现,通络止痛外治法能够显著抑制兔KOA模型滑膜细胞炎症因子生成;将该方君药桂枝的有效成分桂皮醛作用于人离体KOA滑膜细胞上,结果显示桂皮醛通过影响NF-κB通路上参与KOA滑膜炎症反应的许多基因表达,来调控DAMPs/Toll样受体(TLRs)介导的NF-κB炎症通路,进而干预KOA滑膜炎症。但该方的成方做为干预方式的研究尚未涉及,具体作用机制也不尽清楚。故本课题拟使用通络止痛方作为干预药物,通过人体细胞实验,动物实验利用观察应用荧光实时定量PCR、蛋白质免疫印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光及HE染色等技术,检测TLRs/MyD88信号通路中相关元件(TLR2、TLR4、MyD88等),及该通路相关炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)等的浓度变化,初步探讨通络止痛方治疗KOA的分子作用机制及作用靶点。第一部分临床实验KOA患者滑膜TLRs/MyD88信号通路相关炎症因子与膝骨关节炎病情进展的相关性研究目的.:检测人KOA滑膜中TLRs/MyD88信号通路下游炎症因子MMP-13、IL-6的浓度,根据Kellgren&Lawrence标准,结合受试者X线将其分期,观察MMP-13、IL-6在各期的浓度。探讨炎症因子MMP-13、IL-6与KOA病程进展的内在联系,寻找反映KOA病程进展的生化指标。为KOA更早的临床诊断和治疗提供一定参考和帮助。方法:从本院骨科门诊或住院病人中随机选择关节镜或者膝关节置换治疗膝骨性关节炎病人60例,采用中华医学会骨科学分会制定的《骨关节炎诊治指南》(2007年版)标准,按照X线分期(Kellgren&Lawrence分级)标准分为早、中、晚期3组,每组各20例患者作为实验组,对照组随机选20例急性下肢创伤(排除膝关节内损伤)患者,取术中膝关节关节液,处理后采用ELISA检测MMP-13、IL-6的等炎症介质的浓度。观察实验组各组间及实验组与对照组MMP-13、IL-6的浓度有无统计学差异,并分析其与KOA严重程度相关性。结果:1.实验组各组关节液1L-6的浓度随KOA病情进展浓度降低,早期、中期1L-6的浓度高于对照组,晚期1L-6的浓度低于对照组,P<0.05,有统计学差异。2.实验组各组关节液MMP-13的浓度随KOA病情进展浓度浓度浓度升高,实验组各组关节液MMP-13的浓度高于对照组MMP-13的浓度,P<0.05,有统计学差异。3.实验组不同组间1L-6、MMP-13浓度有统计学差异,P<0.05。结论:KOA病变严重程度与MMP-13与IL-6的浓度密切相关,随病程的进展,IL-6浓度越低,随病程的进展,MMP-13浓度越高,提示在KOA早期没有骨性改变的情况下,观察关节液中MMP-13与IL-6含量可作为KOA早期诊断和治疗的指标。第二部分细胞实验通络止痛方通过TLRs/MyD88信号通路对KOA滑膜炎症的影响实验一通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜成纤维细胞增殖及周期的影响目的:探讨通络止痛方对人膝关节骨性关节炎(KOA)滑膜成纤维细胞增殖及周期的影响。方法:取本院行全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织,经Ⅰ型胶原酶消化后进行原代培养,取3～4代成纤维细胞进行高、中、低浓度通络止痛方干预。应用四甲基偶氮唑盐法测定(MTT)法、流式细胞术(FCM)对KOA滑膜细胞的增殖及周期进行测定,并用倒置显微镜下观察各浓度下的细胞形态。结果:加药组组间与加药组与空白组比较,差异有统计学意义(P<O,05)。MTT法检测随通络止痛方浓度减小KOA滑膜细胞在490nm波长处吸光OD值数越大;高中浓度组抑制率为正值,随浓度增加抑制率增大,低浓度抑制率为负值,随浓度减低抑制率减少。高、中、低浓度通络止痛方可以延长细胞周期中的G2(P<0,05)期并同时缩短S(P<0,05)期,抑制KOA滑膜炎性细胞增殖。结论:高、中浓度通络止痛方对滑膜细胞增殖有抑制作用,低浓度组的通络止痛方对滑膜细胞有增殖作用有待进一步研究。实验二通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞1L-1 β、TNF-α、MMP-13及NO的影响目的:观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清lL-1β、TNF-α、MMP-13及N0含量的影响。方法:取本院行全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织,进行原代培养,取3～4代成纤维细胞进行不同浓度浓度通络止痛方干预,具体分为:高浓度组:(2.5mg/mL)、中浓度:(0.25mg/mL)、低浓度组:(0.025 mg/mL),对照组:(Omg/mL)。采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1 β、TNF-α、MMP-13及NO浓度的变化。结果:高、中、低浓度组较对照组上清液中IL-1β、TNF-α、MMP-13及NO含量显著降低(p<0.05),且下降的幅度与通络止痛方的浓度呈正相关(1L-1β:r=0.39,p<0.05;TNF-α:r=0.41,p<0.05;MMP-13:r=0.36,p<0.05;NO:r=0.52,p<0.05)。IL-1 β、TNF-α、MMP-13及NO的高浓度组达到抑制高峰,与中、低浓度组比较,差异亦有统计学意义(p<0.05)。结论:通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎症细胞上清1L-1 β、TNF-α、MMP-13及NO有抑制作用,随浓度增高,抑制程度越明显。实验三通络止痛方对人膝骨关节炎关节液1L-1 β、HA及NO的影响目的:观察通络止痛方对人膝骨关节炎关节液1L-1β、透明质酸(Hyaluronic,HA)及一氧化氮(NO)含量的影响。方法:行关节镜手术患者,在术中抽取关节腔内积液,离心后取上清,加入不同浓度通络止痛方干预,分为:高浓度组:2.5mg/ml;中浓度:0.25mg/ml;低浓度组:0.025 mg/ml;和对照组(磷酸缓冲盐溶液,PBS)。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测观察各浓度组对关节液干预后1L-1 β、HA及NO含量的变化。结果:高、中、低浓度组较对照组关节液中1L-1 β及NO含量明显降低(p<0.05),且1L-1β及NO的浓度与通络止痛方的浓度呈正相关(1L-1 β:r=-0.29,p<0.05;NO:r=-0.51,p<0.05)。高、中、低浓度组较对照组关节液中HA含量明显升高(p<0.05),且HA的浓度与通络止痛方的浓度呈正相关(HA:r=0.59,p<0.05)。结论:通络止痛方对关节液中1L-1 β及NO有抑制作用,浓度越高抑制程度越大,通络止痛方对关节液中HA有促进作用,浓度越高促进程度越大。实验四通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞T0ll样受体的影响目的:观察通络止痛方对人膝骨关节炎滑膜炎性细胞TOll样受体(Toll-like receptors,TLR)的影响。方法:取本院行全膝关节置换术患者术中废弃滑膜组织,进行原代培养,取3～4代成纤维细胞进行不同浓度浓度通络止痛方干预,具体分为:高浓度组:(2.5mg/mL)、中浓度:(0.25mg/mL)、低浓度组:(0.025 mg/mL),对照组:(0mg/mL)。应用al-time PCR检测细胞内TLR4 mRNA表达情况,应用流式细胞术(FCM)检测细胞中TLR2、TLR4表达情况。结果:与对照组比较,高、中浓度组通络止痛方人膝骨关节炎滑膜炎症细胞TLR4 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05)。低浓度组通络止痛方对滑膜炎症细胞TLR4 mRNA抑制作用与对照组相近,差异无统计学意义。中、高浓度组抑制作用与浓度呈正比。高、中、低浓度通络止痛方组TLR4表达率与对照组比较都有明显的降低(p<0.05),且随着浓度升高,TLR4的表达率逐渐降低;高、中、低浓度通络止痛方组TLR2表达率与对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论:高、中、低浓度通络止痛方均可以显著抑制TOll样受体的表达,提示通络止痛方可能通过TOll样受体(Toll like receptor,TLR)通路影响或抑制人膝骨关节炎滑膜炎症反应。第三部分动物实验通络止通方对不同程度膝骨关节炎TLRs/MyD88信号通路的影响实验一通络止痛方对不同程度膝骨关节炎组织形态学和固有免疫的影响目的:评估通络止痛方对不同程度膝骨关节炎软骨和滑膜结构和固有免疫的影响。方法:利用经典Hulth法建立轻度、中度、重度大鼠KOA动物模型,运用超声促透通络止痛方的方法对大鼠KOA模型进行干预,分别通过观察滑膜及软骨形态学变化确定病变程度,并对软骨进行Mankin’ s评分。利用免疫荧光双标技术,观察参与软骨和滑膜结构破坏的主要蛋白TLR4、NF-κ B、MyD88的变化。结果:2、4、8周组各组内通络止痛方干预组滑膜和软骨损伤程度较对照组明显减轻。在固有免疫中,各组内通络止痛方干预组的TLR4、NF-κB、MyD88的表达较对照组减弱。结论:通络止痛方对不同程度膝骨关节炎均有抑制作用,证明通络止痛方可以通过抑制TLRs/MyD88信号通路相关原件的表达,抑制膝骨关节炎的发生和发展。实验二通络止痛方对不同程度膝骨关节炎TLRs/MyD88信号通路相关原件表达的影响目的:研究通络止痛方对不同程度膝骨关节炎TLRs/MyD88信号通路相关原件表达的影响。方法:利用经典Hulth法建立轻度、中度、重度大鼠KOA动物模型,运用超声促透通络止痛方的方法对大鼠KOA模型进行干预,应用Western blot、PCR技术明确通络止痛方对不同程度KOA滑膜组织TLR4、MyD88、NF-κB表达趋势的影响。结果:各周组中三种指标在中药组中的表达量均明显低于未干预组及盐水组,未干预组与盐水组表达含量相似。结论:通络止痛方对不同程度膝骨关节炎均有抑制作用,证明通络止痛方可以通过抑制TLR4、NF_κB、MyD88的表达,抑制膝骨关节炎的发生和发展。