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背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第5位，死因第3位；其发病率和死亡率有逐年上升趋势。我国乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌发生的主要原因，每年死于肝癌的人数达到11万，居我国癌症死亡的第二位。肝癌发病十分隐匿，临床上仅有不到30％的病人就诊时可获得手术治疗的机会。对大多数中晚期患者，治疗的选择很局限，预后凶险。肝癌自然病程短，进展快，病死率高，严重威胁着我国国民的健康和生命。肝癌的发生发展是一个复杂的多病因、多阶段、多因素参与的过程。肝癌的发生一般要经过慢性肝炎→肝硬化→肝癌的病理过程，其中涉及到众多基因异常表达改变。抑癌基因的突变缺失、癌基因的异常扩增与表达、多基因的协同作用，基因本身的多效性以及机体免疫因素决定最终肿瘤表型的表达。用一次只能检测少量基因且操作复杂费时的传统实验方法研究肝癌基因改变有很大的局限性，新近发展的基因表达分析平台——基因芯片技术以其自身的高通量、微量化、平行化、自动化检测优点从众多方法中脱颖而出。基因芯片技术是以微阵列方式将大量特定高密度寡核苷酸或基因片段固定在某种介质(玻片、硅片、尼龙膜等)上，检测特定基因表达的一项技术。基因芯片技术的理论基础是核酸杂交。基因芯片技术可以准确高效的同时在全基因组范围内同时分析待测样本中成千上万个基因的表达情况以及它们之间相互作用的关系。本研究采用含19378个已知基因的Affymetrix U133 plus2.0寡核苷酸基因芯片研究正常肝脏、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌组织基因表达谱，对共同表达的差异基因进行分析，探讨相关基因变化与肝癌发生过程中的可能内在联系。材料与方法正常肝组织9例，慢性乙型肝炎(以下简称肝炎)组织13例，乙型肝炎肝硬化(以下简称肝硬化)组织6例，HBV相关性肝癌组织15例。肝炎组织取自安阳市五院2006年2月～2006年4月肝活检组织，余均取自河南省人民医院2005年3月～2005年6月肝脏手术切除组织(正常肝组织取自健康供体)。肝炎、肝硬化、肝癌组织标本HBsAg均阳性，正常肝组织HBsAg阴性。疾病诊断均经病理证实。标本取出后迅速置于液氮冷冻，冻存待用。按Invitrogen公司的Trizol试剂盒操作程序Trizol一步法抽提正常肝组织及肝炎、肝硬化和肝癌组织总RNA。使用QIAGEN公司的QIAGEN RNeasy Kit进一步纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳(180V，0.5h)检测总RNA的28S和18S比例，以评估总RNA的完整性；用分光光度计在260／280nm测定总RNA吸光度，以计算总RNA的纯度。按Affymetrix公司芯片制作要求，进行生物素标记的cRNA合成，并将其片段化处理。然后分别与含有19378个已知基因的寡核苷酸芯片进行杂交，Gene array Scanner3000 7G激光共聚焦扫描，采用GenePix Pro 3.0软件读取芯片探针信号并进行扣本底、标准化处理，计算基因的Ratio值(肝炎、肝硬化、肝癌芯片探针信号／正常肝组织芯片对应探针信号)。差异基因筛选标准：Ratio≥2为上调基因，Ratio≤0.5为下调基因。采用Microsoft Excd及Gominer软件对差异基因数据进行分析。查阅NCBI(http://www.pubmed.com)，GENEONTOLOGY(http://www.geneontology.org)，KEGG(http://www.biorcart.com)数据库，获取肝癌相关基因信息。结果1．各组总RNA提取结果良好，总RNA的吸光度OD260／OD280值均在1.8～2.0，热稳定实验显示70℃1h与20℃1h电泳条带比较，28s条带无明显降解，mRNA主要集中于0.9～4.0kb的连续条带。电泳结果证实已抽提高纯度的RNA。2．本实验结果完全符合Affymetrix U133 Plus 2.0基因芯片质量控制标准，信号强度达到要求。检测系统正常，保证杂交结果的可靠性。3．以正常肝组织为对照比较，筛选出肝炎、肝硬化、肝癌差异基因表达谱。通过对其进行生物信息学比对分析，筛选出在肝炎、肝硬化、肝癌中共同差异表达的基因81个，包括原癌基因、抑癌基因、细胞信号传导相关基因、细胞周期相关基因、代谢酶类相关基因、免疫相关基因、肿瘤相关抗原等。有53个基因持续上调表达，28个基因持续下调表达；其中已知功能基因66个，未知功能基因15个。结论1．有多种基因共同参与肝癌发生的整个过程。利用基因芯片技术分析肝癌基因表达谱变化，能够快速筛查肝癌相关基因及其在肝癌中表达情况。2．筛选出的81个与肝癌发生相关的差异表达基因在肝炎、肝硬化阶段已有异常表达，说明它们可能参与了肝癌发生的整个过程。3．对这81个差异表达基因功能分析有助于肝癌发生机制的深入研究，为寻找理想的肝癌肿瘤标志物和探索基因治疗提供线索。4．有些异常表达基因尚未在肝脏病变中报道，其在肝癌发生中的可能作用未知。研究这些新发现的基因在肝癌发生中的作用是下一步工作的任务。