论文部分内容阅读
研究背景大量研究证实,脑胶质瘤中异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因的突变状态与患者的预后密切相关。其中IDH1基因突变90%发生在R132位点上(由精氨酸突变为组氨酸,即CGT→CAT)。该位点突变的患者较未突变的生存期有显著提高,是未突变患者的4倍(81.1个月VS19.4个月)。另外,IDH1基因突变的同时对于MGMT启动子甲基化的患者不仅拥有较长的生存期还增强了对替莫唑胺的敏感性。因此,明确患者的IDH1基因突变状态对于临床判断预后及制定治疗方案极为重要。通常脑胶质瘤IDH1基因突变采用直接测序法进行检测,但该方法对肿瘤细胞的突变率要求较高,对于突变比例低于20%的标本容易被忽略。为了提高脑胶质瘤中IDH1基因突变检测效率,本课题建立较ARMS PCR的更有效的增强型ARMS PCR法检测方法。目的从方法学方面,分析增强型ARMS PCR法检测脑胶质瘤IDH1基因R132H位点突变的敏感性和特异性。用于临床样本检测时,比较增强型ARMS PCR法与直接测序法检测脑胶质瘤IDH1基因R132H位点突变率的一致性。方法1.分别采用分子克隆技术和定点突变技术,构建idh1基因野生型和r132h位点突变阳性质粒标准品。1.1idh1基因野生型质粒标准品的构建采用rt-pcr扩增idh1基因,将idh1基因与pjwc载体在t4dna连接酶的作用下构建重组质粒(pjwc-idh1),将重组质粒转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞中,通过酶切和测序鉴定。验证正确后,将其作为pjwc-idh1基因野生型质粒标准品备用。1.2idh1基因r132h位点突变阳性质粒标准品的构建运用primerpremier6.0软件设计pjwc-idh1基因r132h位点突变引物,扩增出pjwc-idh1基因r132h位点突变阳性片段。对胶回收后的产物进行末端平滑化及5′磷酸化处理后自身连接并将其产物进行测序分析。验证正确后,将其作为pjwc-idh1基因r132h位点突变阳性质粒标准品备用。2.评价增强型armspcr法的敏感性和特异性2.1采用primerpremier6.0软件设计idh1基因r132h位点突变引物和监测基因的taqman探针引物。2.2敏感性检测:以pjwc-idh1基因野生型和pjwc-idh1基因r132h位点突变阳性质粒标准品为模板,按照突变质粒标准品分别占野生质粒标准品的50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、阴性对照、空白对照一系列浓度比例,梯度稀释并混合均匀。运用增强型armspcr法的反应条件和反应程序操作,检测最低敏感性。2.3特异性检测:以pjwc-idh1基因野生型质粒标准品为模板,将野生质粒标准品分别按照5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、45ng、50ng、阳性对照、空白对照一系列的量为模板,运用增强型armspcr法,检测非特异性扩增ct值与内参ct值,综合评价特异性。2.4增强型armspcr法与直接测序法的比较:以pjwc-idh1基因r132h位点突变型质粒标准品占健康人基因组dna的50%、20%、10%、1%一系列浓度为检测模板,分别采用增强型armspcr法和直接测序法检测突变率,比较两种方法的最低检出率。3.增强型armspcr法的临床应用3.1选取30例脑胶质瘤石蜡包埋组织,采用QIAamp DNA蜡块提取试剂盒提取DNA,测浓度。3.2依据本课题创建的增强型ARMS PCR法的反应条件及反应程序,检测IDH1基因R132H位点突变情况。3.3运用直接测序法的反应条件,检测上述30例标本的IDH1基因R132H位点突变情况,验证上述结果。3.4统计学分析比较两种方法的符合率和Kappa值。结果1.成功构建IDH1基因野生型和R132H位点突变阳性质粒标准品。2.增强型ARMS PCR敏感性和特异性检测2.1设计增强型ARMS PCR引物共四条:一对为特异性突变ARMS引物,另两条分别为非人源接头引物和Taqman探针引物。2.2敏感性检测,可准确检测出含量低至0.05%的突变DNA。检测最低限,即为仅混有16.65拷贝的突变体就可以检测出来。2.3特异性检测,在50ng的相对高质量的野生质粒背景下,经过50个循环扩增,检测IDH1基因R132H位突变未见非特异性扩增。特异性较强,即在16700拷贝的野生质粒背景下,仍然未有假阳性的出现。2.4增强型ARMS PCR法与直接测序法的比较,增强型ARMS PCR法能检测出1%的突变混合物,然而直接测序法不能检测出突变比例低于20%的突变混合物。3.增强型ARMS PCR法检测IDH1基因R132H位点突变与直接测序法结果相比符合率为100%,Kappa值为1。结论本课题所建立的增强型ARMS PCR检测脑胶质瘤中IDH1基因突变具有敏感性高、特异性强、简单快捷的特点,可在临床推广使用。