论文部分内容阅读
PevD1是本实验室从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)发酵液中分离纯化的一种新蛋白激发子,能引起烟草类似HR的细胞坏死反应,并诱导烟草产生系统抗病性,但是烟草如何识别PevD1而激发烟草抗病反应的作用机理尚不清楚。作者实验室前期利用酵母双杂交和双分子荧光标记技术在烟草细胞中鉴定了一个PevD1的互作蛋白Nbnrp1。本研究在前期基础上,用酵母双杂交和GST Pull-down技术进一步确定Nbnrp1与PevD1结合的功能结构域;荧光观察Nbnrp1和PevD1在烟草细胞中的共定位;通过转基因技术获得了Nbnrp1过表达本生烟植株和Nbnrp1沉默本生烟植株;通过比较两种转基因本生烟与野生型本生烟对PevD1诱导的细胞坏死和抗病性的变化,明确Nbnrp1参与了蛋白激发子PevD1诱导的抗病性。为进一步探索蛋白激发子PevD1诱导烟草抗性信号传导途径提供科学依据。本研究获得的主要研究结果如下:1、确定了Nbnrp1与PevD1互作的功能结构域生物信息学分析显示Nbnrp1含有DCD结构域,据此,构建pGADT7-Nbnrp1△N(DCD结构域)和pGADT7-Nbnrp1△C重组载体,并分别与pGBKT7-PevD1转化到酵母细胞中,检测发现仅Nbnrp1△N即DCD结构域与PevD1特异性结合。为了进一步明确Nbnrp1的DCD结构域与PevD1互作,用GST pull-down技术进行了互作验证。首先构建原核表达载体pGEX-6P-2-Nbnrp1△N,用大肠杆菌表达系统获得了可溶性的重组表达蛋白;经GST亲和层析技术和阴离子交换层析技术纯化表达蛋白,得到了GST-Nbnrp1△N的单一蛋白条带,表观分子量约为41kDa。将His-PevD1蛋白和GST-Nbnrp1△N蛋白进行GST pull-down,SDS-PAGE分析显示,GST-Nbnrp1△N蛋白能与His-PevD1蛋白在体外特异结合。进一步确定了Nbnrp1的DCD结构域是Nbnrp1与PevD1结合的功能结构域。2、Nbnrp1蛋白与PevD1蛋白在烟草细胞中的共定位构建瞬时表达载体pYBA1132-Nbnrp1和pCAM1032-PevD1-RFP,通过农杆菌介导法在烟草中共表达。激光共聚焦显微镜下观察到,带绿色荧光的Nbnrp1与红色荧光PevD1在烟草细胞中能够重合并发出黄色荧光,表明Nbnrp1蛋白与PevD1能共定位在亚细胞器细胞核与细胞质。3、Nbnrp1过表达本生烟的获得及基因功能的研究构建植物表达载体pBI121-Nbnrp1,利用农杆菌介导的叶盘转化法得到Nbnrp1过表达本生烟植株共137个株系;其中83株呈阳性。47株T1代转基因烟草中,阳性植株为34株,阴性植株为13株,分化比例约为3:1。Southern Blot鉴定了阳性转基因植株为单拷贝。与野生型植株相比,PevD1处理的Nbnrp1过表达烟草植株出现坏死斑的时间早,所需诱导浓度低,HR标记基因HRS203J的转录表达量上调;Nbnrp1过表达烟草植株对TMV的抑制率提高41.2%,对假单胞杆菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抑制率提高91.1%,并且抗病相关基因PR1-a和PR1-b也显著上调表达。4、Nbnrp1沉默本生烟的获得及基因功能的研究选取DCD结构域所在的编码序列作为干扰片段,采用RNAi的方法对本生烟Nbnrp1基因进行沉默。构建了中间载体pRNAi1017-SA,将带有内含子的正反向序列插入到植物过表达载体pCAMBIA2300中,成功构建了载体pCAMBIA-RNAi-Nbnrp1。利用农杆菌介导的叶盘转化法获得Nbnrp1干扰植株共116个株系;PCR检测56株呈阳性;37株T1代植株中,阳性植株为28株,阴性植株为9株,分化比例约为3:1。阳性植株的Nbnrp1基因沉默效率达80%以上。与野生型植株相比,PevD1处理后Nbnrp1沉默植株对PevD1诱导的细胞坏死敏感性降低,表现为坏死斑出现的时间晚,所需PevD1诱导的浓度高;HR标记基因HRS203J的表达量下调。PevD1处理后,Nbnrp1基因沉默烟草植株的抗病性减弱,对TMV的抗病性降低了71.7%,对假单胞杆菌的抗性降低了67%;而且抗病相关基因PR1-a和PR1-b也下调表达。