藻多糖(Algniat e)是条件致病菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos a)产生的一种重要的毒力因子,是铜绿假单胞菌分泌的三种主要多糖之一。这种多糖主要是从患有囊胞性纤维症(铜绿假单胞菌的感染是引起该病发病和死亡的主要原因)的患者肺部分离得到的铜绿假单胞菌所产生,此菌是一类粘液型的铜绿假单胞菌,藻多糖是此菌致病和在患者体内生存的主要原因之一。同时,铜绿假单胞菌的耐药性和Algniate有很大关系。研究表明,这种多糖能够清除中性粒细胞和激活的巨噬细胞释放的专门杀死病原体的自由基。因为这种多糖与铜绿假单胞菌的致病性息息相关,因此对这种多糖的合成的研究是比较透彻的。目前的研究表明,在铜绿假单胞菌体内合成Algniate的13种蛋白质通过形成一个横跨细胞内膜、周质空间、细胞外膜的复合体来行使功能。敲除参与Algniate合成的膜蛋白糖基转移酶Alg8和c-di-gmp结合膜蛋白Alg44导致Algniate无法分泌,这说明Alg8和Alg44是这种多糖聚合所必须的。Alg44在合成藻多糖的过程中有重要作用,但是关于具体的调控机制却不是很清楚。所以我们选择了铜绿假单胞菌中Alg44作为我们主要的研究对象,希望从蛋白结构方面对该蛋白的作用机制做出阐释。Alg44是一个单次跨膜的细胞质膜蛋白,N端位于细胞质,是一个PilZ结构域,是一个典型的c-di-gmp结合结构域,研究表明,结合了c-di-gmp的N端结构域对Algniate合成是必需的,C端结构域位于周质空间,可能与形成大的蛋白质复合物有关。我们尝试通过分子克隆和膜蛋白纯化方法对Alg44全长蛋白进行纯化,但是遗憾的是没有成功,我们又尝试着进行了结构域片段的截取,截取的片段有N端PilZ结构域的多个片段,以及C端结构域的多个片段。我们获得了可溶的PilZ结构域蛋白(16-122),并且通过普筛获得了不带有组氨酸标签的PilZ结构域和c-di-gmp的复合物的晶体,进行优化后获得性状良好的晶体,在上海同步辐射光源(SSRF)收集并处理了晶体数据,利用coot,ccp4,phenix,CNS等软件解析了Alg44 PilZ结构域的结构。经典的PilZ结构域通常是一个单体结合两个c-di-gmp,但是有趣的是,从我们的结构上却看到一个单体结合了三个c-di-gmp,其中有一个与蛋白质单体没有任何接触,我们猜测可能是由于c-di-gmp量过多引起的,于是我们就将c-di-gmp和蛋白的比例从原来的5：1变为了3：1,解析出的蛋白质结构中c-di-gmp和蛋白质单体的结合变成了经典的2：1,两个c-di-gmp和蛋白质平行排列。我们观察到了c-di-gmp在蛋白质结构中的多态性,我们认为这并不是偶然出现的,c-di-gmp可以以多种方式帮助蛋白质有规律的折叠,这是以前都没有报道过的。PilZ结构域的晶体中,一个不对称单元中有两个单体,在晶体结构中是个二体,通过分析柱分析发现,在溶液中,该蛋白质也是二体的状态。为了弄清该二体的形成是否是因为c-di-gmp的原因,我们根据晶体结构,突变了c-di-gmp的结合位点,构建了Q18A, R17A,以及Q18AR17A双突变体,通过分析柱分析发现,c-di-gmp并没有影响二体的状态, c-di-gmp不结合时该蛋白也是二体状态。在周质空间的C端结构域的蛋白质不可溶,通过优化培养条件,优化培养基以及想通过蛋白质之间的相互关系,来得到可溶的蛋白质,但遗憾的是,都没有成功。后来我们利用纯化包涵体的方法得到了可溶的蛋白。