研究背景及研究目的肺癌(lung cancer)是世界上发病率和死亡率最高的肿瘤,全球每年有180万新发病例,在2012年死亡病例多达160万。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在所有肺癌病例中占比超过了五分之四,其中包括大细胞癌,鳞状细胞癌和腺癌。尽管非小细胞肺癌的治疗已经有很大的进步,但是5年生存率仍然低于15%;对于IV期肺癌患者,其5年生存率仅约有1%。非小细胞肺癌患者容易发生骨、脑等转移,是其生存率较低的主要原因。化疗是非小细胞肺癌治疗的主要手段,特别是顺铂在治疗前期效果是很明显的,但是在后期由于化疗耐药等原因,治疗和预后不佳。因此,研究非小细胞肺癌转移和顺铂耐药的分子机制,从而寻求新的分子标记物或治疗靶点显得尤为重要。Canopy homolog2(CNPY2)属于CNPY家族,是一种新型的分泌蛋白,广泛分布于人的心、肝、胰腺等各种组织中。CNPY家族还有CNPY1、CNPY3和CNPY4成员;它们具有相似的结构域结构,包括共有信号肽,鞘脂激活蛋白B型结构域和内质网(endoplasmic reticulum,ER)回收序列,但没有疏水性跨膜结构域。目前有关于CNPY2的研究资料是有限的。近年来,已有文献研究发现,CNPY2可以影响血管平滑肌细胞的血管重塑能力、以及增殖和迁移行为。缺氧情况下,缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)结合于CNPY2的启动子上游区域,CNPY2的表达上调,从而促进平滑肌细胞的增殖、迁移和组织血管生成。据报道,在结直肠癌中,沉默CNPY2的表达能抑制肿瘤生成和血管生成,并且能促进细胞凋亡。目前有关于CNPY2在非小细胞肺癌发生发展中具体的生物学功能还没有报道。因此,本文主要目的是在体外实验中初步研究CNPY2癌基因在非小细胞肺癌侵袭、转移以及顺铂耐药过程中的影响,提供一些CNPY2在非小细胞肺癌中充当原癌基因角色的实验数据,进一步地为深入阐明CNPY2基因导致非小细胞肺癌恶性进展的分子机制奠定了理论基础。此外,我们将在后续的动物实验和临床样本中深化我们的假说,更进一步地探讨CNPY2是否具备成为肺癌早期诊断及预后评估的分子靶点的潜力。研究方法1.数据库预测CNPY2在非小细胞肺癌中发挥的作用:通过公共平台癌基因组图谱(TCGA)分析非小细胞肺癌主要分型与癌旁正常组织中CNPY2的表达情况;使用公开的Kaplan-Meier绘图仪数据库绘制非小细胞肺癌患者中CNPY2过表达组和CNPY2沉默组的总体生存曲线。2.检测CNPY2在非小细胞肺癌组织中的表达:收集9名非小细胞肺癌患者癌及2例癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR实验和免疫蛋白印迹实验检测CNPY2和E-Cadherin的表达情况。3.构建过表达和沉默CNPY2的亚细胞系:通过实时荧光定量PCR实验和免疫蛋白印迹实验,检测原代支气管上皮BEAS-2B细胞和8株非小细胞肺癌细胞系(H2087,H810,H1563,A549,H2228,H2291,H358和H1568)中CNPY2的表达;筛选稳定的A549细胞系,建立过表达和沉默细胞内源性CNPY2蛋白表达的细胞。4.体外检测CNPY2对迁移和侵袭的影响及其机制研究:通过Transwell实验和细胞划痕修复实验观察CNPY2对A549细胞的侵袭和迁移能力的影响。通过免疫蛋白印迹实验检测与EMT有关分子E-cadherin、Vimentin和Snail的表达,以及AKT/GSK3β信号通路中p-GSK3β、GSK3β、p-AKT、AKT蛋白的表达。随后,利用Perfosine(AKT/GSK3β抑制剂)刺激细胞后,通过Transwell实验和细胞划痕修复实验进一步检测CNPY2对细胞侵袭和迁移能力的影响。5.检测各株细胞系对顺铂的敏感性:通过细胞活性实验和平板克隆实验,分别检测顺铂处理的原代支气管上皮BEAS-2B细胞和8个非小细胞肺癌细胞系(H2087,H810,H1563,A549,H2228,H2291,H358和H1568)中半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和细胞克隆形成能力。6.体外检测CNPY2对顺铂耐药性的影响及其机制研究:通过平板克隆形成实验、Annexin V-FITC法和TUNEL法,检测CNPY2对顺铂处理过的A549细胞的增殖、凋亡能力的影响。免疫蛋白印迹实验检测A549-CNPY2细胞中凋亡调控因子caspase-3,c-IAP1,c-IAP2,XIAP,Bcl-2和Bcl-xl的表达。双荧光素酶报告基因实验方法测定CNPY2对NF-κB信号通路转录活性的影响;免疫蛋白印迹实验检测CNPY2对NF-κB通路的重要调节因子IκBα和IKK磷酸化水平的影响。予以NF-κB信号通路抑制剂IκBα-mut、NF-κB和IKK抑制剂,以及广谱caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)处理细胞,通过平板克隆形成实验、Annexin V-FITC法和TUNEL法检测NF-κB信号通路对CNPY2诱导的顺铂耐药性的影响。研究结果1.公共平台TCGA分析结果显示,与癌旁正常组织相比,CNPY2在非小细胞肺癌的两种主要类型腺癌和鳞状细胞癌中的表达均明显增高。利用公开的Kaplan-Meier绘图仪数据库分析非小细胞肺癌肺癌患者CNPY2 m RNA表达水平与总生存期(OS)的关系,发现CNPY2过表达组的肺癌患者其总生存期高于CNPY2沉默组的肺癌患者。2.CNPY2在非小细胞肺癌临床样本中的表达比在癌旁正常组织中的表达升高;且CNPY2的表达与EMT标记物E-cadherin呈负相关关系。3.在A549细胞系成功构建过表达CNPY2的亚细胞系,包括Vetor和A549-CNPY2;同时也成功在A549细胞系构建沉默CNPY2的亚细胞系,包括scramble和si CNPY2#1和si CNPY2#2。4.体外细胞实验结果显示,过表达CNPY2后促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移,E-cadherin表达降低、Vimentin和Snail的表达增高。此外,CNPY2激活AKT/GSK3β信号通路,p-GSK3β和p-AKT表达增高。抑制AKT/GSK3β信号通路后,CNPY2诱导的EMT现象和促进细胞转移的作用减弱。5.予以顺铂处理原代支气管上皮BEAS-2B细胞和8个非小细胞肺癌细胞系后,与H2291细胞相比,内源性表达CNPY2较高的H1563和H358细胞,其IC50较低和平板克隆数目较多。6.对过表达或敲低CNPY2的细胞予以顺铂刺激,结果发现过表达CNPY2增加平板克隆数目和降低细胞凋亡数目,促进细胞对顺铂的耐药性;而沉默CNPY2则减少平板克隆数目和增加细胞凋亡数目,提高了细胞对顺铂的敏感性。过表达CNPY2促进凋亡调控因子c-IAP1,c-IAP2,XIAP,Bcl-2和Bcl-xl的表达。此外,CNPY2能显著提高NF-κB转录活性,激活NF-κB信号通路。NF-κB信号通路激活后,抑制通路重要抑制因子的表达,增强抗凋亡作用,进而促进CNPY2诱导的顺铂耐药性。研究结论1.CNPY2的表达水平与非小细胞肺癌患者的临床病理分期、生存预后可能存在相关;CNPY2有一定潜力可作为非小细胞肺癌诊断和判断临床预后的蛋白标志物。2.CNPY2促进非小细胞肺癌的恶性进展,CNPY2能激活AKT/GSK3β通路,诱导EMT发生,进而促进非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭能力。3.CNPY2激活NF-κB信号通路,促进NF-κB下游基因的转录,增强了顺铂诱导下非小细胞肺癌细胞的存活和抗凋亡,从而对顺铂产生耐药性。