抗西洋参病原真菌蛋白的分离、纯化及其基因的合成和在大肠杆菌中的表达

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真菌病害是西洋参(Panax quinquefolium L.)的最主要病害,造成西洋参大量减产。化学防治不但不能从根本上解决问题,还引起农药残留和污染。为此,笔者拟从分子生物学角度,筛选广谱性的植物抗菌蛋白,克隆或人工合成其基因,使其在西洋参植株上得到表达,以提高西洋参自身的抗病能力,达到防病和增产的目的。目前,笔者已筛选出较理想的抗菌蛋白,并将其基因人工合成和在大肠杆菌中得到表达。 通过筛选,笔者在美洲商陆种子中分离得到一个具有明显抑制西洋参病原真菌黑斑病菌(Alternaria panax)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和镰刀菌(Fusarium sp.)活性的蛋白,但对疫霉菌(Phytophthora cactorum)没有作用,可能为几丁质结合蛋白。将该蛋白纯化后分析表明,其分子量约为7000Da,等电点为11,热稳定性好,其N-末端氨基酸序列为:Ala-Gly-Gys-Ile-Lys-Asn-Gly-。据此可以确定该蛋白为PAFP-S。 根据PAFP-S蛋白的氨基酸序列,人工合成其基因时,设计了四段相互互补的寡核苷酸序列Primer1(65bp),Primer2(65bp),Primer3(65bp)和Primer4(64bp)作为引物,用递归PCR方法合成pafp-s基因,再经过与pGEMT vector连接,筛选出所需要的克隆。DNA序列测定表明,合成的pafp-s基因与设计的预期结果完全一致。 将PAFP-S的基因克隆到pRSETB表达载体上,构建了pafp-s基因的非融合蛋白表达载体pRSETB-210。用IPTG对pRSETB-210在大肠杆菌(PLYS)中进行诱导表达,经电泳观察表明pafp-s基因在pRSETB上得到了表达,表达量为0.67%;经转膜后,对表达蛋白N-末端15个氨基酸的测定表明,其氨基酸序列和PAFP-S蛋白的序列一样,证实了pafp-s基因得到了表达。另外,将pafp-s基因克隆到PUC18上得到了pUC18-210,再由pUC18-210切下基因克隆到pTrcA His表达载体,得到融合型的表达载体pTrcA-210经过IPTG诱导后,经电泳观察表明,pafp-s基因在pTrcA-210上以融合蛋白得到表达。表达量为2.27%。 笔者首次合成得到抗菌蛋白PAFP-S的基因,鉴于PAFP-S有较广谱的抗菌活性,尤其对农作物重要病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和镰刀菌(Fusarium sp.)有明显的抑制活性,所以在抗病育种方面具有广阔的应用前景。
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