研究背景Alport综合征(Alport sydrome, AS)是一种常见的遗传性肾小球疾病,以持续性血尿、晶体及眼底改变、高频神经性耳聋及进行性肾功能衰竭为主要临床特征。AS有3种不同的遗传方式,85%为X连锁显性遗传(X-linked Inheritance AS, XLAS),由编码α5链的COL4A5基因突变所致,病变基因定位于Xq21-q22;15%是常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive Inheritance, ARAS),其致病基因是COL4A3或COL4A4基因,病变基因定位于2q35-q37；罕见的有常染色体显性遗传(Autosomal dominant inheritance AS, ADAS),致病基因亦为COL4A3或COL4A4基因。过去认为AS为一种罕见病,早期调查发现AS的发病率为1：5000～10000我国大样本资料显示,全国儿科2315例行肾活检的患者中,AS占1.2%,随着诊断技术的进步以及对遗传病认识的提高和重视,临床上可见越来越多有关AS的报道。AS目前尚无特异性的根治方法,患儿多进展至终末期肾功能不全。在儿童终末期肾病(End-stage Renal Disease, ESRD)中,AS患儿约占3%。因其危害性极大,越来越引起临床医生的关注。但AS患儿发病隐匿、临床表现多样,相当一部分患儿临床表现不典型,临床医师极易漏诊或误诊,且AS预后较差,因此早期鉴别和诊断AS具有重要的临床意义。目前认为对于AS诊断较为可靠的标准为3条：电镜下肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)出现典型的超微结构改变；皮肤或肾组织基底膜Ⅳ型胶原α链表达异常；COL4A5/3/4基因突变。临床上30%的AS患者基底膜Ⅳ型胶原α链可无缺失表达,目前该现象并无确切的机制进行阐述,推测是因为某些突变对Ⅳ型胶原α链的结构和功能影响不大所致。AS患儿在疾病早期,电镜下肾小球基底膜可表现正常或仅表现为弥漫性变薄,并非所有AS均表现为GBM弥漫厚薄不均、分层甚至断裂等特征性病理改变。因此,对于基底膜Ⅳ型胶原α链表达正常或电镜下GBM未出现典型超微病变者,亦不能轻易排除AS。对于AS而言,临床表现以及肾组织(或皮肤)的Ⅳ型胶原α链染色及肾组织电镜检查仅为AS的诊断提供辅助资料,确诊该病最可靠的标准是基因诊断。AS相关致病基因有3个,分别为COL4A5基因(51个外显子)、COL4A3基因(52个外显子),COL4A4基因(48个外显子),因其外显子数目庞大且无热点突变,基因诊断并未广泛开展。传统的Sanger法测序认为是遗传病基因诊断的“金标准”,但其耗时、费力且价格昂贵,对于外显子数目庞大的AS致病基因并不适用。第二代高通量基因测序(Next generation squencing, NGS)较以往的测序技术而言,具有高通量、速度快、低成本的特点,利用NGS一方面能检测出遗传病已知的致病基因,另一方面还可发现未知致病基因突变或新的基因突变位点。国内采用该技木对AS家系进行研究的报道较少,多为病例报导或少数家系的基因突变分析。因此,本研究通过收集30例疑似及确诊AS的患儿,通过完善肾脏病理、临床表现及基因检测等资料,确立AS患儿的个体化诊断,进一步分析AS患儿的基因突变及临床表型特征,明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作。另外研究中检测到两例患儿存在同义突变,分别为c.3246G>A (p.1082K>K)、 c.465G>A (p.155K>K),更新了传统认为“同义突变不致病”的观念,为同义突变的功能验证研究提供了依据。目的本研究通过收集30例疑似及确诊AS的患儿,通过收集AS患儿家系的临床资料,初步分析AS临床表型的特点；通过完善肾脏病理、临床表现及基因检测等资料,确立AS患儿的个体化诊断,丰富AS的诊断深度；分析AS患儿的基因突变数据,明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作。方法选取2005年1月至2015年10月在南京总医院儿科病区住院确珍或疑似AS的30例患儿为研究对象。通过基因测序后所有患儿均符合AS诊断标准。收集患儿及家系中患者的性别、起病方式、眼耳病变情况、肾脏损伤表现等资料；收集肾组织病理资料,包括肾组织光镜、免疫荧光、电镜及肾组织基底膜Ⅳ型胶原检查结果,对AS患儿的临床表现进行初步分析。经征得本院伦理委员会批准,患儿家长同意并签署知情同意书后,收集30个AS家系成员的外周血标本,应用二代测序外显子序列捕获技术,对30个疑似和确诊AS患儿的全外显子组基因进行测序,分别设计针对突变位点的引物对其直系家属进行Sanger测序验证。通过dbSNP数据库、人类基因突变及相关基本疾病数据库(HMGD数据库)等公共数据库的过滤筛选突变基因,经SIFT软件对突变基因位点进行蛋白功能预测。对基因突变结果进行分析,确立AS患儿个性化的诊断体系。通过家系分析对AS双基因模式进行初步探讨。本研究统计分析均采用SPSS19.0软件进行。计量资料以均数±标准差(x±S)表示,两独立样本采用t检验,多组独立样本采用单因素方差分析；计数资料以率表示,采用Fisher确切概率法。以a=0.05作为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1 AS患儿临床表型的初步分析30例患儿均有不同程度的血尿(100%),镜下血尿者19例(63.33%),男性患儿15例,女性患儿4例；肉眼血尿者11例(36.67%),男性患儿5例,女性患儿6例。不同性别患儿间血尿程度无统计学差异(P=0.108)。镜下血尿者发病年龄为1月～10岁,平均发病年龄2.86±2.46岁；肉眼血尿者发病年龄为1岁～6岁,2.55±1.29岁。两者发病年龄无统计学差异(t=0.388,P=0.701)合并蛋白尿者23例(76.67%),男17例,女6例,无蛋白尿者7例(23.33%),男3例,女4例。根据24小时尿蛋白定量结果,将伴有不同程度蛋白尿的患儿分为四组,A组为阴性组,B组为少量蛋白尿组,C组为中等量蛋白尿组,D组为大量蛋白尿组。其中A组7例(23.33%),男3例,女4例；B组4例(13.33%),男3例,女1例；C组15例(50%),男12例,女3例；D组4例(13.33%),男2例,女2例。四组间男女患儿的构成比无统计学差异(P=0.322)。A组患儿平均发病年龄为2.71±1.11岁,B组患儿平均发病年龄4.05±2.85岁,C组患儿平均发病年龄为2.47±2.47岁,D组患儿平均发病年龄为2.50±0.58岁,四组间患儿的发病年龄无统计学差异(P=0.621)。30例患儿肾功能均处于CKD 1期,肾外表现少见,仅1例男性患儿(6.25%)9岁时检测出双侧对称性感音神经性,轻度听力下降23例患儿行肾穿刺活检,肾小球微小病变(MCD)13例(56.5%),系膜增生性肾小球肾炎(MsPNG)10例(43.5%),23例患儿均通过肾组织冰冻切片间接免疫荧光法检测肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链表达,其中完全或部分表达缺失19例(82.6%),另4例患儿肾组织Ⅳ型胶原α3、α5链表达正常。9例患儿(39.1%)电镜结果见基膜致密层分层撕裂,呈“花篮样”改变,基膜厚薄不一等AS典型电镜改变,另2例表现为薄基底膜病,6例表现为系膜增生性改变,6例无肾小球。2 AS患儿的基因突变的测序和分析30例AS患儿,共检测出35个COL4A5/3/4基因突变位点,其中包括错义突变19个、同义突变2个、剪切位点突变4个、无义突变3个、插入突变2个、缺失突变4个、复杂突变1个。共发现COL4A5基因突变24个、COL4A3基因突变6个、COL4A4基因突变5个。通过Sanger测序对家系成员进行验证,结果发现20例突变来源于母亲,8例突变来源于父亲,8例为新生突变,1例先证者纯合基因突变分别来自父母双方,1例患儿突变来源不详。本研究共发现31例突变类型未见疾病报道。结合患儿临床表现、肾组织病理检查、家族史调查、基因突变分析,所有患儿均能明确诊断为AS。两例患儿(成员1、25)检测到COL4A5基因同义突变,分别为c.3246G>A(p.1082K>K)、c.465G>A(p.155K>K),经家系分析认为两个同义突变均具有致病性。XLAS患儿共26例,男性患儿16例,女性患儿10例。15例患儿的基因突变类型为错义突变(57.69%),2例为无义突变(7.69%),3例为剪切位点突变(13.04%),2例为插入突变(7.69%),2例为缺失突变(7.69%),2例为同义突变(7.69%)。不同突变类型家系患病成员进展至ESRD的年龄差异差异有统计学意义(P=0.018),错义突变进展至ESRD的速度较无义突变、剪切位点突变、框移突变缓慢。XLAS男性患者比女性患者更早进展至ESRD,两者发病年龄差异有统计学意义(P=0.043)。此外研究还发现5例患儿合并2个AS致病基因突变(成员1、5、9、12、25),但并不支持Mencarelli等[4]首次提出AS存在双基因遗传模式的论断成立；结论1 本研究中AS患儿发病年龄小,血尿为最常见的首发症状,均未进展至肾功能不全,肾外表现少见；AS早期肾组织病理光镜表现轻微且无特异性,主要以MCD为主；电镜表现常不典型,Ⅳ型胶原α链免疫荧光染色亦存在局限性,仅根据患儿的临床表型及肾组织病理结果,有可能漏诊或误诊；2基因检测完善了AS患儿的个体化诊断体系,有助于AS的早期诊断；明确AS基因突变类型,丰富AS基因突变数据库,为AS深入的发病机制探讨提供基础工作；3基因检测有利于判断AS患儿的预后情况,不同遗传型及不同基因突变类型的患儿预后均不一致；4通过家系分析,暂不支持AS存在双基因遗传模式。