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前言急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）及其严重表现—急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）是威胁生命的严重疾患，临床上以脓毒症引起的内毒素肺损伤最为常见。针对脓毒症早期炎症介质释放，人们尝试应用各种抗炎性因子治疗，但其较高的发病率与病死率一直无法得到有效控制。近年来，高迁移率族蛋白1（High Mobility Group Box 1，HMGB1）作为内毒素／脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）致死效应的重要晚期因子备受关注，新近研究表明，即使在“早期”炎症介质释放之后应用抗HMGB1抗体，仍可对致命性急性肺损伤动物发挥保护作用，这为临床治疗提供了更宽的时间窗。晚期糖基化终末产物受体（Receptor for Advanced Glycation End-Products，RAGE）是介导HMGB1细胞因子活性的重要受体。除了HMGB1，其配体还包括糖基化终末产物、β淀粉样肽、S100蛋白等。RAGE与其配体相互作用常导致快速持续的细胞活化和下游基因转录，多种细胞信号ERK1／2（p44／p42）、p38 andSAPK／JNK MAP kinases，rho-GTPases，phosphoinositol-3-kinase，and the JAK／STAT在不同类型细胞中被激活，并通过核因子-kappaB（Nuclear Factor-kappaB，NF-κB）持久活化维持和扩大炎症反应。有报道指出，RAGE敲除小鼠能耐受盲肠结扎穿孔引起的感染性休克，表明RAGE在系统性急性炎症过程中发挥重要作用。最近，在人类和小鼠肺内发现几种RAGE的变异体，公认的有可溶性RAGE（soluble RAGE，sRAGE）和内源性分泌型RAGE（endogenous secretory RAGE，esRAGE）。虽然它们的产生机制及分子大小不尽相同，但由于都包括配体结合的细胞外区域而缺乏跨膜区域，因此能与RAGE竞争同RAGE配体的结合，并阻断RAGE信号向细胞内转导。体内外研究证实，应用sRAGE对糖尿病血管病变、创口延迟愈合、迟发型高敏反应、关节炎、结肠炎等多种炎症性疾病动物模型具有保护作用。揭示sRAGE在内毒素致伤后的肺内表达，论证其对急性肺损伤的作用及机制有助于对RAGE通路的理解并为以RAGE为靶点的治疗方向奠定理论基础。目前国内外关于RAGE的研究以慢性炎症性疾病为主，已取得重大进展，但急性炎症相关报道罕见，关于急性肺损伤与RAGE的干预研究更是空白。为明确RAGE及其变异体在内毒素肺损伤发病中的作用，我们建立小鼠LPS肺损伤模型，观察LPS气管内滴注后肺内RAGE及其变异体在蛋白质及转录水平的动态变化；通过sRAGE干预验证其是否对LPS介导的肺损伤发挥保护作用；并从炎症与凋亡两方面评价sRAGE肺损伤保护作用的机制，从而为感染相关性肺损伤的防治开辟新的前景。方法（1）小鼠脂多糖肺损伤模型的建立C57BL／6J小鼠，8-11周龄，体重18-22g，腹腔注射盐酸氯胺酮（100mg／kg体重）和赛拉嗪（10mg／kg体重）麻醉后，经颈正中切口游离气管，以24G套管针行气管穿刺，将套管插入左主支气管，向左肺内注入3mg／kg体重的E．coli LPS（浓度为1.2mg LPS／ml PBS），对照组（PBS组）用相同体积的磷酸盐缓冲盐水（Phosphate-buffered saline，PBS）代替LPS气管内注入。（2）LPS气管内注入后不同时点采集肺组织标本，于24h收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF），用蛋白印记（Western blot）方法分析各时点肺组织匀浆及LPS滴入后24h BALF中RAGE及其变异体蛋白的表达；应用实时定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术检测各时点肺组织中RAGE mRNA和esRAGE mRNA的表达。（3）LPS气管内注入后1h，sRAGE组小鼠接受100ug sRAGE（溶于100ul PBS中）腹腔注射，LPS组在相同时点接受100ul PBS腹腔注射，PBS组于气管内滴注PBS后1h给与100ul PBS腹腔注射。三组动物于气管滴注后24h经腹腔注射戊巴比妥（250mg／kg体重）处死，采集BALF及肺组织，比较气管滴注24h后组间BALF中白细胞计数，白细胞介素-1β（Interleukin，IL-1β）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、巨噬细胞炎症蛋白（Macrophage InnammatoryProtein，MIP-1α）、MIP-1β、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1）、角质细胞起源趋化因子（Keratinocyte-derived Chemokine，KC）8种细胞因子水平（Bio-Plex技术）及肺组织病理学（H．E．染色）表现。（4）为探讨sRAGE对脂多糖引起的肺内NF-κB活化的影响，快速采集上述三组动物LPS注入后4h的肺组织，分离核提取物，应用BDTM TransFactor Chemiluninescent试剂盒分析核提取物中NF-κB P65 DNA结合活性作为评价NF-κB活化的指标。应用末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediaed-dUTP nick end labeling，TUNEL）及激光共聚焦显微镜对上述三组动物LPS注入后24h肺组织石蜡切片行细胞凋亡原位检测，比较各组TUNEL阳性细胞数量。（5）统计分析所有数据以均数±标准误表示，应用SPSS14.0统计学软件进行单因素方差分析和学生t检验，各组间差异用最小显著差法进行Post Hoc检验，P＜0.05认为有统计学意义。结果1、RAGE及其变异体在LPS肺损伤小鼠肺内的表达应用抗RAGE细胞外区域的特异性抗体行Western blot检测，发现RAGE蛋白在未经处置的0h组小鼠肺组织匀浆中呈现三条条带，分子量分别约为54kD，48kD和38kD。LPS注入后6、12和24h，三条条带强度均无明显变化。相比之下，BALF中只检测到分子量约48kD的单一条带，气管内滴注PBS后24h，该条带表达较弱，滴注LPS后24h，该条带密度显著增强（P＜0.05）。实时定量PCR检测表明，LPS气管内滴注后6h，肺内RAGE mRNA表达显著下降，此后6h、12h、24h呈逐渐下降趋势，各时点与0h（未处置小鼠）相比均具有显著统计学差异（P＜0.01）。相比之下，LPS注入后各时点esRAGE mRNA无显著变化（P＞0.05）。2、sRAGE干预对LPS介导的急性肺损伤的影响与PBS组相比，滴注LPS后24h小鼠BALF中白细胞总数及中性粒细胞数均明显增多（P＜0.01）；LPS后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中白细胞总数及中性粒细胞数均明显降低（P＜0.05）。与PBS组相比，小鼠气管内滴注LPS 24h后BALF中8种细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1 and KC）浓度均显著增高（P＜0.01）；LPS滴注后1h腹腔注射sRAGE的小鼠比腹腔注射PBS的小鼠24h BALF中TNF-α、MIP-1α和MIP-1β水平明显降低（P＜0.05），但两组间其他5种细胞因子水平未见显著性差异（P＞0.05）。光镜下观察H．E染色肺组织切片发现，气管内滴注后24h，PBS组肺泡结构完整，未见明显中性粒细胞浸润和间质水肿。LPS组肺泡结构紊乱，肺泡腔内大量中性粒细胞聚集，伴有明显肺泡壁增厚、肺泡毛细血管充血渗出，部分肺泡萎陷。sRAGE组肺内中性粒细胞浸润较LPS组明显减轻，肺泡壁充血水肿也明显缓解。3、sRAGE对LPS介导的肺内NF-κB活化和细胞凋亡的影响LPS气管内滴注后4h，肺内NF-κB p65 DNA结合活性较PBS组明显增强（P＜0.01），LPS后1h sRAGE腹腔注射显著抑制了LPS引起的NF-κB活化（P＜0.05）。竞争分析证实了NF-κB与DNA的特异性结合。TUNEL检测显示，气管内滴注后24h，PBS组仅有个别肺泡上皮细胞核呈现绿色荧光的阳性染色，LPS组阳性细胞数显著增多（与PBS组比较P＜0.01），sRAGE组阳性细胞数比LPS组明显减少（P＜0.05）。结论（1）RAGE及其变异体在正常肺组织中表达丰富，脂多糖刺激引起其可溶性变异体向肺泡腔内释放增多。由全长RAGE蛋白水解导致C-末端截断形成sRAGE是脂多糖介导的肺泡腔中可溶性RAGE变异体的可能来源。（2）应用sRAGE阻止RAGE信号可抑制脂多糖引起的小鼠肺内中性粒细胞聚集、致炎细胞因子产生和肺组织病理改变，对脂多糖介导的急性肺损伤具有保护作用。（3）sRAGE抑制脂多糖引起的NF-κB活化和肺泡上皮凋亡，通过抗炎和抗凋亡双重机制对脂多糖介导的急性肺损伤发挥保护作用。