研究背景结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)和胃癌(Gastric cancer,GC)是全球范围内常见的消化道恶性肿瘤[1]。尽管近年来肿瘤早期筛查、早期诊断以及辅助综合治疗手段的不断进步使得CRC和GC患者的预后显著提高,然而GC和CRC仍然是恶性肿瘤死亡的主要原因[1,2]。如何控制进展期CRC和GC的肿瘤远处转移,进而提高患者的无进展生存期(Progression-free survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)依旧是困扰肿瘤临床治疗的重大难题[3,4]。因此,对于促肿瘤转移机制的深入研究以及关键节点分子的鉴定是肿瘤研究领域需要解决的关键科学问题之一。胞外核苷酸水解酶CD39和CD73是细胞外腺苷的主要来源(图1)[5]。作为酶促反应的限速成分,CD39和CD73是将肿瘤微环境中免疫刺激性三磷酸腺苷(ATP)转换为免疫抑制性腺苷(ADO)的关键检查点分子[5,6]:CD39首先水解细胞外ATP和二磷酸腺苷(ADP)转换成一磷酸腺苷(AMP),随后在CD73协同作用下催化生成ADO,后者通过与T、B、NK等多种免疫细胞表面的腺苷受体(A1、A2A、A2B及A3)结合,广泛介导免疫调节效应[7,8]。此外,既往研究结果证实CD39和CD73分子与肿瘤的发生、发展和转移密切相关;CD39/CD73/ADO代谢通路直接参与调控肿瘤细胞的生长、分化、侵袭、迁移、肿瘤血管生成以及肿瘤远处转移[5,9,10]。因此,进一步明确其在肿瘤患者中的表达特征和预后意义,能够为靶向CD39/CD73的肿瘤免疫治疗提供理论基础[5,11]。有趣的是,近期在小鼠肿瘤模型中的研究发现,针对CD39/CD73的小分子抑制剂或单克隆抗体在机体内具有良好的耐受性,并且能够明显抑制小鼠肿瘤的生长和转移[11,12],其可能机制为重塑T和NK细胞抗肿瘤免疫应答以及抑制调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)介导的免疫抑制[11,13]。并且,小鼠肿瘤模型中证实靶向CD73同时,能够有效提高肿瘤免疫检查点(Tumor immune checkpoint,TIC)——负性共刺激分子CTLA-4以及PD-1抑制剂的抗肿瘤效应,表明针对TIC多靶点联合用药可能是肿瘤免疫治疗的新方向[14]。值得关注的是,CD39和CD73分子作为新型TIC在实体肿瘤中表达上调与肿瘤分期、转移、治疗应答以及预后密切相关(表1)[5,6,11,13,15,16];近期研究证实CD73可作为判断CRC患者能否从接受靶向表皮生长因子(EGF)治疗(西妥昔单抗)中获益的预测因子[16]。然而,CD39/CD73分子在CRC和GC患者中表达的临床病理意义尚未明确。因此,我们在本研究中重点分析了CD39和CD73分子在CRC和GC患者肿瘤组织中的表达分布特征、临床病理意义以及预后价值。第一部分CD73分子在结直肠癌患者中的表达和临床意义目的:鉴于CD73是肿瘤组织中水解产生免疫抑制性介质腺苷的主要胞外核苷酸酶,本部分研究旨在评价CD73分子在CRC患者肿瘤组织中表达的临床病理特征以及预后意义。方法:采用免疫组化(IHC)方法检测CD73在新鲜CRC肿瘤组织以及直肠腺癌组织芯片(n=90例,TNM I-IV期)中的表达特征,并以Aperio Image Scope软件定量分析CD73蛋白的平均阳性表达强度。通过激光捕获显微切割方法分离5例m CRC配对标本的上皮细胞和间质成分,以实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测CD73m RNA表达水平。此外,采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)方法检测CRC肿瘤原发灶、肿瘤引流淋巴结和肝转移灶中CD73蛋白表达水平。统计分析CD73与肿瘤病理特征以及患者预后的相关性。结果:相比较正常对照组织,CRC肿瘤组织中CD73的蛋白和m RNA表达水平明显上调;不仅CRC肿瘤上皮细胞的胞浆与包膜表达CD73,而且肿瘤间质中血管内皮细胞、肿瘤浸润免疫细胞也表达CD73。除肿瘤原发灶之外,CD73在m CRC肿瘤引流淋巴结和肝转移灶中的表达水平同样明显升高。肿瘤细胞中CD73高表达可作为CRC患者预后不良的独立预测因子;然而,肿瘤间质中CD73高表达者具有较好的肿瘤病理特征(T和TNM分期较早)和总生存期。值得注意的是,联合分析CRC肿瘤细胞及肿瘤间质中CD73的表达能够提高其判断预后的临床价值,其中CD73在肿瘤细胞中高表达、而在肿瘤间质中低表达的患者预后最差。结论:CD73在CRC肿瘤上皮细胞与肿瘤间质中表达上调。尽管肿瘤细胞中CD73高表达可作为患者预后不良的独立预测因子,联合分析CD73在肿瘤上皮细胞及肿瘤间质成分中的表达水平能够提高其判断预后的临床价值。第二部分CD39分子在结直肠癌患者中的表达和临床意义目的:CD39是催化免疫刺激性分子ATP水解为免疫抑制性介质ADO的关键胞外核苷酸酶。在本部分研究中我们拟评价CRC患者肿瘤组织中CD39分子表达的临床病理意义和预后价值。方法:采用IHC检测CD39在新鲜CRC组织标本(包括肿瘤原发灶、肿瘤引流淋巴结、肝转移灶)以及直肠腺癌组织芯片(n=90例,TNM I-IV期)中的表达特征,并以Aperio Image Scope软件定量分析CD39蛋白的平均阳性表达强度。通过激光捕获显微切割方法分离5例m CRC患者的肿瘤上皮细胞和配对正常对照组织的上皮细胞,以RT-PCR检测CD39 m RNA表达水平。此外,采用WB检测CRC肿瘤原发灶、肿瘤引流淋巴结和肝转移灶中CD39蛋白表达水平。统计分析CD39表达水平与肿瘤病理特征和患者预后的相关性。结果:相比较正常对照组织,CRC肿瘤细胞中CD39的蛋白和mRNA表达水平明显上调;并且,CD39在m CRC患者的肿瘤引流淋巴结和肝转移灶中表达水平同样升高。尽管肿瘤细胞CD39高表达的患者具有较好的肿瘤病理特征(N和TNM分期较早)和总生存期,但多因素分析证实CD39不能作为判断患者预后的独立预测因子。此外,我们发现肿瘤细胞中CD39与CD73的表达水平无显著统计学差异,但存在正相关;而联合分析CRC肿瘤细胞中CD73与CD39表达能够提高其判断预后的价值,其中肿瘤细胞中CD73高表达、CD39低表达的患者预后最差。结论:CRC肿瘤上皮细胞中CD39表达水平可能与肿瘤TNM分期相关。尽管肿瘤细胞中CD39高表达者术后生存时间更长,但CD39不能作为判断患者预后的独立预测因子,而联合分析CD39与CD73的表达能够提高其判断预后的价值。第三部分CD39/CD73在胃癌患者中的表达和临床意义目的:评价CD39与CD73分子在胃癌患者肿瘤组织中的表达特征以及临床病理意义。方法:采用IHC检测CD39/CD73在新鲜GC肿瘤组织(n=42例,TNM I-III期)以及肿瘤引流淋巴结中的表达特征,以Aperio Image Scope软件定量分析CD39/CD73表达强度。采用RT-PCR以及WB方法检测GC肿瘤组织中CD39/CD73 m RNA以及蛋白表达水平。统计分析CD39/CD73表达水平与肿瘤病理特征的相关性。结果:GC肿瘤组织中CD39/CD73主要表达于肿瘤上皮细胞的胞浆与包膜,而在肿瘤间质中局限于血管内皮细胞和少量淋巴细胞。与正常对照相比较,尽管肿瘤组织中CD39/CD73 m RNA表达水平与正常对照无显著统计学差异,但其蛋白表达水平明显升高。GC肿瘤上皮细胞中CD73表达水平与肿瘤TNM分期相关,而CD39表达水平与肿瘤临床病理特征未见有明显统计学相关。结论:CD39/CD73在GC患者肿瘤细胞中的表达水平明显上调,其中CD73表达水平与肿瘤TNM分期相关,但CD39/CD73的预后意义有待进一步研究。