禽流感是由A型流感病毒引起的禽类传染病,近十年来,以H5N1型为代表的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza, HPAI)肆虐全球,不仅给世界养禽业造成损失,甚至出现了越来越多的人感染H5N1型禽流感致死病例,已有人传人禽流感病例的报道[5-6]。由于人体内没有针对禽流感病毒的抗体,特别是针对H5抗原的抗体,所以人感染H5N1型禽流感病毒后具有较高的致死率,对人类健康和世界公共卫生安全已构成重大威胁。目前针对人间H5N1型禽流感大流行的防控措施主要有两种,一是疫苗[10-11],但由于流感病毒不同毒株间存在抗原差异且变异频繁[12],使得新开发的疫苗往往滞后于疫情暴发[13]。二是化学药物,主要包括M2蛋白阻滞剂,如金刚烷胺和金刚乙胺；神经氨酸酶抑制剂,如奥司他韦和扎那米韦等。但化学药物过量使用会产生耐药性和容易引起服用者精神异常等副作用[16-17]。作为疫苗和化学药物的有效补充,由抗体介导的预防和临床治疗措施已显现良好的效果,其应用前景得到专家的认同[18-19]。因此,研发人源化或全人源基因工程抗体用于禽流感临床治疗具有重要的应用价值。利用噬菌体展示技术构建全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌体抗体库,筛选具有广谱中和活性的scFv抗体,并对其保守中和表位进行分析,为H5N1型禽流感的防治提供一个候选抗体药物,也为亚单位疫苗的研制提供新的思路。研究方法1.构建全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌体抗体库取40位经H5N1型禽流感疫苗免疫志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录cDNA；用人源特异性抗体引物扩增VH、Vκ、Vλ基因,再经过重叠PCR制备scFv基因；将scFv片段与pComb3XSS同时经SfiI酶切、连接后电转化入宿主菌E.coli XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清经PEG8000/NaCl沉淀,制备抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌体抗体库。2.杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA1亚基以A/Jiangsu/1/2007(H5N1)为模板,提取病毒基因组RNA,反转录为cDNA,扩增HA1基因,酶切产物与重组质粒pFastBac连接筛选阳性重组质粒；阳性克隆进一步转化E.coli DH10Bac感受态细胞获得阳性重组子HAl-rBacmid转染Sf9细胞,待细胞病变后收集重组病毒液,经传代后制备高滴度病毒溶液并进一步感染Sf9细胞,72h后分别收集培养上清和细胞沉淀,Western blot检测重组蛋白HA1的表达,亲和柱纯化HA1蛋白,SDS-PAGE电泳检测及质谱鉴定。3.HA1特异性scFv抗体的筛选及表达以纯化的重组H5N1型禽流感病毒HA1蛋白包被酶标板,加入扩增的抗体库孵育,依次进行三轮“吸附一洗脱一扩增”富集筛选,从第三轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选单克隆,制备噬菌体抗体,并用phage-ELISA鉴定。阳性克隆经序列分析后,进行可溶性抗体表达、纯化和特异性鉴定。4.具有广谱中和活性的scFv抗体的鉴定及中和表位分析MDCK细胞微量中和试验、Western blot、间接免疫荧光、血凝抑制试验等对纯化的scFv抗体进行鉴定筛选出具有广谱中和活性的抗体；应用噬菌体肽库,结合蛋白3D结构模型及点突变检测技术分析中和抗体与HA蛋白的结合表位。5.中和性scFv抗体对H5N1型禽流感病毒感染鸡胚的保护作用H5N1型禽流感病毒感染10日龄鸡胚,分别进行鸡胚预防和治疗试验。鸡胚预防试验,首先给鸡胚注射25、50、75、100、200μg/kg scFv抗体,30min后再给鸡胚注射10LD50的病毒。鸡胚治疗试验,首先给鸡胚注射给10LD50的病毒,1h后,给鸡胚注射100、150、200、250、500μg/kg scFv抗体,观察各组鸡胚8d后的存活情况,计算各组抗体的保护率。研究结果1.构建免疫型scFv噬菌体抗体库：采用噬菌体展示技术,经2轮PCR扩增得到scFv基因片段约750bp,100次电转化后导入E.coli XL1-Blue中,构建了库容为6.0×108的全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌体抗体库。2.重组蛋白HAl的表达：将阳性重组质粒pFastBac-HA1双酶切后,含有pFastBac(4700bp)和HA1(1000bp)两个带；用M13通用引物对重组表达质粒HA1-rBacmid进行PCR鉴定,扩增的片段大小为3400bp,与预期相符；将HA1-rBacmid病毒种子液以10倍感染复数接种Sf9细胞,Western blot表明在培养上清和细胞沉淀中均有重组蛋白HA1的表达。SDS-PAGE显示纯化后的重组蛋白分子量大小为43kD,即为HA1蛋白的大小。质谱鉴定结果证明表达的蛋白与H5N1型禽流感病毒的HA1蛋白的同源性最高。3.噬菌体抗体的筛选及可溶性抗体的表达：以纯化的HA1为抗原,从scFv噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,随机挑取的564个克隆经鉴定25个克隆能与HA1蛋白特异性结合；经测序分析,筛选出9株序列不同的scFv抗体,可溶性表达后利用His亲和层析柱纯化scFv抗体。4.scFv抗体中和活性的鉴定及序列分析：9株scFv抗体分别与100TCID50的6株不同clade的H5N1型禽流感病毒混合孵育后加入MDCK细胞中,3d后检测细胞病变,其中4株scFv抗体(3D1、3F5、4F5、6F9)可与6株病毒起中和反应,证明它们具有广谱的中和活性,中和反应浓度(IC50)从0.39-45μg/ml。4株scFv抗体与病毒株进行Western blot检测,6株病毒均能检测到70kD、43kD的2条带,分别为HA0及HA1蛋白的大小,证明scFv识别的抗原决定簇在HA1亚基上；免疫荧光可见各株病毒感染后的细胞有特异性红色荧光；4株scFv抗体分别与6株病毒孵育后均能引起鸡红细胞血凝抑制,血凝抑制活性HI与IC50成正相关,进一步证明scFv识别的结合位点在HA1亚基。测序显示4株scFv抗体HCDRs区氨基酸序列完全相同,对其中的3株进行HRP标记并进行竞争ELISA检测,结果表明4株scFv抗体与重组HA1蛋白结合时存在相互竞争作用,从而证明它们结合的是HA1蛋白的同一表位。5.广谱中和活性scFv抗体保守中和表位的分析：4株scFv抗体混合液包被ELISA板进行噬菌体肽库的筛选,20个随机克隆中有18个含有共同的WLLP氨基酸序列,与6株病毒的HA序列第76-81位氨基酸WLLGNP相似,推测其可能是scFv抗体与HA蛋白的结合位点；利用蛋白结构软件预测scFv抗体的结合位点位于HA的E抗原区附近,WLLGNP也位于此区域；将WLLGNP突变为WRRGNP后重新转入杆状病毒-昆虫细胞表达系统,scFv抗体无法识别突变的HA1蛋白,进一步证明WLLGNP为4株scFv抗体的结合表位。6. scFv抗体对H5N1型禽流感病毒感染鸡胚的预防和治疗保护作用：预防试验结果表明,scFv抗体对禽源和人源H5N1型禽流感病毒的保护率均可达100%；治疗试验结果表明,scFv抗体对禽来源的H5N1型禽流感病毒的感染具有100%保护率,对人源的H5N1型禽流感病毒也可产生62.5%的保护率。结论1.利用噬菌体展示技术成功构建了库容量为6.0x108的全人源抗H5N1型禽流感病毒免疫型scFv噬菌体抗体库,为筛选全人源抗H5N1型禽流感病毒抗体奠定了基础；2.筛选获得具有广谱中和活性的全人源scFv抗体4株,明确了保守的中和表位WLLGNP,为亚单位疫苗的研制提供新的思路。3.中和活性scFv抗体对病毒感染的鸡胚具有较好的保护作用,该抗体的获得不仅为H5N1型禽流感的防治提供一个候选抗体药物,也为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望。