[背景]肿瘤严重威胁人类健康和生命。在我国,每年新发肿瘤312万,死亡200万,肿瘤约占所有死因的1/5,目前我国肿瘤平均治愈率仅10%左右。肿瘤在各类疾病死因中已从20世纪50年代的第9位迅速上升到目前的第一(城市)二位(农村)。随着环境的恶化,人类平均年龄的增加,肿瘤的发病率和死亡率还在明显增加。早期研究主要认为肿瘤通过诱导机体不应答或弱应答进而逃避机体免疫系统攻击,认为诱导或增强机体免疫系统的杀伤机制在肿瘤治疗中至关重要。采用肿瘤抗原增强机体特异性免疫活性在早期研究里成为大多数肿瘤免疫治疗研究的首选方案。但是在临床实验中发现,采用增强免疫治疗方法中,只有少部分病人(<5%)病情得到改善。早在1971年,Sehon等人就提出了肿瘤患者可能存在发挥免疫抑制作用的细胞的可能性,这些细胞在肿瘤生长及逃逸中发挥重要作用。随着近期人们对肿瘤研究的深入,发现肿瘤在发生过程中能够激发患者的免疫应答,活化后的免疫细胞具有杀伤肿瘤细胞的完全活性。只是在肿瘤患者体内或局部确实有着一些免疫抑制机制,使肿瘤逃避免疫攻击。通过肿瘤模型以及临床资料的进一步研究,人们确定,在肿瘤的发生发展过程中,调节性T细胞(Treg),骨髓来源抑制性细胞(MDSC),肿瘤相关巨噬细胞,不成熟的DC等组成一个复杂的免疫调节网络,它们协助肿瘤逃避免疫系统的监视和杀伤,诱导免疫耐受。临床标本分析也证实在肿瘤患者中这些细胞水平增高也与患者预后密切相关,针对这些细胞的一些治疗方案也能对肿瘤的治疗发挥作用。细胞凋亡后能够主动参与免疫调节机制,细胞凋亡和免疫耐受有密不可分的关系。凋亡细胞在体内不仅仅是被清除,而且还会释放或者促进吞噬细胞释放大量的抗炎性因子,激活一系列信号途径,下调免疫反应,诱导免疫耐受。大量研究证实,凋亡细胞在自身免疫、肿瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等过程中均发挥重要的作用。研究认为细胞凋亡后诱导免疫耐受的机制可能包括：1.抑制抗原递呈细胞,凋亡细胞被APC吞噬后,促使APC分泌免疫抑制因子,抑制APC分泌促炎因子,使APC表现为免疫静息状态。2.通过诱导产生Treg细胞抑制免疫细胞,3.调节抑制性细胞因子TGF-β1和IL-10的分泌,产生免疫抑制。4.直接抑制T细胞等的活化。在肿瘤的发生发展时,会伴随着大量肿瘤细胞凋亡。治疗性药物促使肿瘤细胞凋亡虽然可以起到暂时或者局部减少肿瘤细胞数量的效果,但是机体针对肿瘤的免疫耐受现象并没有得到改善,促进肿瘤细胞凋亡的临床治疗方案在实际应用中并没有取得相应的理想效果。肿瘤在发生发展过程中免疫耐受形成的机制至今仍不清楚,但是免疫系统介导的免疫抑制是肿瘤免疫逃逸的一个重要机制。细胞凋亡后能够促使机体特定免疫耐受的形成。肿瘤在成长的过程中往往也伴随着大量的肿瘤细胞凋亡。这些肿瘤中存在的凋亡肿瘤细胞在肿瘤导致的免疫逃逸发生过程中是否存在着一个主动机制,是否参与或被动推动了免疫耐受的发生?本研究将从凋亡肿瘤细胞的角度对肿瘤免疫耐受形成机制进行分析,为进一步解释肿瘤免疫耐受机制,为肿瘤的免疫治疗及预防提供理论基础。[目的]1.建立小鼠EL4肿瘤模型。2.建立诱导EL4细胞凋亡的方法。3.研究凋亡的EL4细胞预免疫对小鼠肿瘤模型的影响。4.揭示凋亡肿瘤细胞影响肿瘤形成的相关免疫细胞及细胞因子机制。[方法]1.按照相关文献所述,将处于对数生长期的5×104个EL4细胞接种在C57BL/6小鼠右胸部皮下,等量PBS缓冲液接种为对照组,观察每只小鼠进食、活动度、成瘤时间,测量肿瘤大小并记录。2.采用UVB紫外线照射法诱导EL4细胞凋亡,摸索不同照射时间、不同孵育时间等条件改变下细胞的最佳诱导凋亡条件。采用异硫氰荧光素(FITC)标记的钙磷脂结合蛋白V (Annexin-V)和碘化丙啶(PI)双染,流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.将C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为凋亡细胞组、坏死细胞组、对照组。凋亡细胞组小鼠腹腔每间隔7天连续输注2次1×106个凋亡的EL4细胞,坏死细胞组小鼠腹腔每间隔7天连续输注2次1×106个坏死的EL4细胞,对照组小鼠腹腔每间隔7天连续续输注2次等量的PBS缓冲液,在第二次输注7天后,每组每只小鼠右胸部皮下接种5×104个EL4细胞,观察每只小鼠进食、活动度、成瘤时间,测量肿瘤大小并记录。4.将C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为凋亡细胞组、坏死细胞组、对照组。各组免疫方法同前。第二次输注7天后,断髓法处死小鼠,留取小鼠外周血、脾脏细胞,流式细胞术检测外周血和脾脏中Treg和Th17比例。ELISA法检测血清中TGF-β1和IL-10的含量。[结果]1.建立了稳定的小鼠肿瘤模型,小鼠在成瘤实验后的第8±1.75天可见肿瘤,随着肿瘤的增大,小鼠活动、进食减少,24±1.75天死亡。2.UVB紫外线法诱导EL4细胞凋亡,在照射距离10cm,照射时间60分钟,细胞密度为1×106个/ml,转速11Orpm摇晃细胞条件下,照射后37℃孵育60分钟细胞凋亡率为23.11%,孵育90分钟细胞凋亡率为31.52%,孵育120分钟细胞凋亡率为47.02%,孵育180分钟凋亡率超过90%。3.凋亡细胞预输注组小鼠的成瘤时间为6±1天,坏死细胞预输注组小鼠的成瘤时间为12±2天,PBS缓冲液预输注组小鼠的成瘤时间为8±2天。三组相互比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.凋亡细胞组Treg细胞比例(%)为：脾脏(4.49±0.56),外周血(5.06±0.36)。坏死细胞组Treg细胞比例(%)为：脾脏(1.37±0.24),外周血(1.34±0.32)。对照组Treg细胞比例(%)为：脾脏(2.13±0.33),外周血(2.50±0.72)。三组小鼠体内Treg细胞比例相互比较差异有统计学意义(P<0.05)。凋亡细胞组体内Th17细胞比例(%)为：脾脏(1.54±0.95),外周血(1.56±0.83)。坏死细胞组体内Th17细胞比例(%)为：脾脏(2.37±0.89),外周血(2.48±0.92)。对照组体内Th17细胞比例(%)为：脾脏(1.34±0.78),外周血(1.24±0.87)。凋亡细胞组小鼠体内Th17比例与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。凋亡细胞组小鼠体内Treg/Th17的比例(%)为：脾脏(2.91),外周血(3.24)；坏死细胞组小鼠体内Treg/Th17的比例(%)为：脾脏(0.58),外周血(0.54);对照组小鼠体内Treg/Th17的比例(%)为：脾脏(1.59),外周血(2.01)。在预免疫不同的细胞后,小鼠血清中的IL-10的含量分别为：凋亡细胞组(200.5±98.2)pg/ml,坏死细胞组(12.5±8.75)pg/ml,对照组(16.5±7.5)pg/ml；凋亡细胞组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠血清中TGF-β1的含量分别为：凋亡细胞组(448.5±54.5) pg/ml,坏死细胞组(7.5±3.37)pg/ml,对照组(9.75±5.25)pg/ml,凋亡细胞组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.5×104个EL4细胞皮下注射可以稳定有效的建立C57BL/6小鼠肿瘤模型。2.UVB紫外线照射法可以有效的诱导EL4细胞凋亡。3.凋亡肿瘤细胞预输注后可以显著缩短小鼠的成瘤时间。坏死肿瘤细胞预输注则可以显著延长小鼠成瘤时间。4.预免疫凋亡肿瘤细胞后,小鼠体内Treg细胞比例显著升高,小鼠血清中IL-10、TGF-β1含量升高。预免疫坏死细胞后,小鼠体内Treg细胞比例则显著降低,小鼠体内Th17细胞比例升高。