临床研究显示,心脏肥大不仅是心脏对各种刺激的代偿反应,而且是心脏病发病和死亡的独立危险因素,是心力衰竭,心源性猝死的最常见原因,许多心血管疾病如高血压、瓣膜病、心肌梗死和肥厚型心肌病等均伴有心脏肥大,同时许多内在的和外在的刺激如内分泌失调、缺血、神经体液因子和细胞因子等都可以诱导心脏肥大,其特征是心脏肥厚,心肌细胞排列紊乱和间质纤维化。现在认为心肌长期负荷过度是引起心脏肥大的主要原因,其发生机制十分复杂,血管紧张素Ⅱ的升高,心肌肥大肽的产生,胶原改建的直接作用以及前后负荷介导的机械牵拉、热休克蛋白的调控保护等,都是心脏肥大必然的和必要的发病机制,其中机械负荷是一个很重要的激发因素。一般的观点认为心肌细胞是终末分化的细胞,出生后不久即失去了增殖的能力,因此,当心脏处于血流动力学超负荷压力下时,心肌细胞数量并没有增加而体积增大,产生适应性心肌肥厚增加收缩力,减小室壁张力以对抗增加的负荷,但随着负荷的持续增加,出现失代偿,即非心肌细胞数量增加并且产生许多细胞外基质蛋白如胶原和纤维,从而发生左心室重构,最终导致心脏的功能失调。长期的心脏肥大可导致许多心脏疾病如扩张型心肌病、充血性心衰、心肌梗死、心律失常和心源性猝死。目前临床上对于心脏肥大的治疗仍缺乏有效的手段。虽然心内科治疗方法多样,药物繁多,但是总体疗效并不满意,主要是因为对于心脏肥大的病理生理过程及其产生的分子机制认识不充分,因此,确定心脏肥大的分子机制非常重要,将有助于我们找到预防和治疗的有效措施。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一个25kDa的糖蛋白,由于其能有效地诱导动员骨髓干细胞包括造血干细胞,间充质细胞和内皮祖细胞入血,临床上最初用来治疗中性粒细胞减少和在骨髓移植方案中,近来许多动物研究证实其在心肌梗死等缺血引起的心力衰竭的预防保护中具有重要作用,能改善心功能,缩小梗死面积,其主要机制就是G-CSF能诱导梗死心脏的血管新生,甚至有小部分动员的骨髓干细胞在心脏微环境下转化为心肌细胞的报道,虽然对此观点学术界还有争论,但G-CSF动员骨髓中干细胞至外周血使其“募集”到心脏梗死区,促进血管新生,改善心肌重构的作用是明确的。最近研究发现G-CSF对心肌细胞具有直接保护作用,其主要机制是G-CSF通过直接作用于心肌细胞上的受体Jak/Stat系统,抑制心肌细胞凋亡,促进其生存,这也是在急性心肌梗死中G-CSF改善心功能的重要机制,这提示我们G-CSF可能对非缺血性心脏病如压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭也有保护作用。这方面的研究很少,曾有类似报道G-CSF可以减轻阿霉素诱导的心肌病的Fas蛋白表达,抑制心肌细胞凋亡,保持心肌超微结构的完整,最终改善心功能,其治疗机制与心肌梗死模型一致,G-CSF能逆转阿霉素诱导的细胞外信号调节激酶(ERK)的失活,且G-CSF的这种有益作用在心肌病已经形成后仍然有效。因此本实验旨在研究G-CSF对压力超负荷引起的非缺血性心室重构及心力衰竭的影响,探究其可能的作用机制,为临床治疗高血压性心肌肥厚和心力衰竭提供新的思路。目前国内国外均趋于利用小鼠压力超负荷模型来研究从心脏肥大逐渐向心力衰竭转变的病理生理和分子机制,故首先探讨如何在短时间内建立压力超负荷模型,应用此类模型揭示心脏肥大的内在分子机制,是具有重要意义的研究课题。第一部分压力超负荷后心肌内转基因小鼠的生物学特性观察目的:探索在短时间内建立小鼠心肌内转基因后压力超负荷模型,为深入研究心脏肥大的分子机制提供可靠的实验对象。方法:雄性C57BL/6小鼠随机分为升主动脉缩窄组(手术组)和同期假手术组(对照组),手术组根据暂时阻断主动脉血流5s、10s、30s同时左心腔内分别注射Ad-LacZ或PBS后又分为LacZ组和PBS组,观察术后4周不同时间小鼠体重、颈动脉血压和心脏超声等变化。HE染色和X-gal染色分别观察心肌肥厚情况和基因转染情况。结果:手术成活率88.8%。升主动脉缩窄小鼠的血压较对照组明显升高。缩窄术后2周心肌明显肥厚,4周时出现失代偿性心力衰竭。X-gal染色显示阻断血流5s以上心脏有蓝染,但10s、30s之间无明显区别。结论:该方法简单有效,重复性好,可在短时间内建立小鼠心肌内转基因和压力超负荷心肌肥厚模型,为心脏肥大的深入研究提供可靠的实验对象。左心室心腔直接注射转染Ad-LacZ基因同时阻断升主动脉血流10s以上可以使目的基因有较好的表达。第二部分G-CSF对压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭的影响目的:探讨粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)对压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭发生发展的影响及其机制。方法:10～12周龄雄性C57BL/6小鼠86只,随机分成7组并给予相应干预:PBS组小鼠(PBS组)、替米沙坦组小鼠(ST组)、G-CSF(A)组小鼠(GA组)、G-CSF(B)组小鼠(GB组)、G-CSF+替米沙坦组小鼠(GT组)、替米沙坦+G-CSF组小鼠(TG组)和假手术组小鼠(Sham组)。小鼠经缩窄升主动脉后,在不同时间皮下注射G-CSF或(和)替米沙坦,每周做心脏超声检测心脏功能和形态变化,分别于第1周、2周和4周末测量右侧颈动脉压后取材,用HE染色、Masson三色染色观察心脏形态变化,用Western blotting检测血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)和RT-PCR检测缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor1,HIF-1)、p53mRNA的表达情况。结果:(1)在0d-14d,缩窄升主动脉的小鼠心室壁厚度值逐渐升高达高峰,14d-28d PBS组厚度逐渐降低,同时伴有左室射血分数的下降,而给予G-CSF皮下注射的小鼠未见有降低,也未见有射血分数的下降;(2)同PBS组比较,VEGF蛋白、HIF-1mRNA表达在给予G-CSF皮下注射的小鼠显著升高,而p53mRNA表达、心脏纤维化程度和死亡率在给予G-CSF组显著降低。结论:G-CSF通过调控血管新生,改善了压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭,其中调控HIF-1的表达可能起着重要的作用。结论1.利用左心室心腔内直接注射后缩窄升主动脉的方法可在短时间内建立小鼠心肌内转基因和压力超负荷模型,左心室心腔直接注射转染Ad-LacZ基因同时阻断升主动脉血流10s以上可以使目的基因有较好的表达;2.G-CSF通过调控血管新生,改善了压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭,其中调控HIF-1和p53的表达可能起着重要作用。潜在价值和创新点1.首次利用腺病毒载体成功将目的基因转染入小鼠心肌细胞建立了转基因小鼠模型;2.在转基因基础上证实经升主动脉缩窄可在短时间内建立心肌内转基因小鼠压力超负荷模型,并应用此模型成功模拟了压力超负荷下从心脏肥大逐渐向心力衰竭转变的病理生理过程,为揭示心脏肥大的内在分子机制提供了可靠的实验对象3.发现G-CSF可能通过调控HIF-1和p53的表达,促进心脏血管新生,可改善压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭的过程。