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本课题依托于国家“十二五”科技支撑计划项目——“食源性功能肽生物制备技术研究”,项目编号为2012BAD33B03,主要从事蛋清肽消化代谢的研究。本文以蛋清源活性多肽中活性较强的肽段RVPSL为原料,通过体外实验建立模拟胃肠道消化代谢模型和细胞共同培养模型,应用分子生物学相关技术对细胞共同培养模型进行评价,并结合超高效液相色谱分析技术分析细胞共同培养模型的代谢产物,最终获得最佳的评价寡肽代谢的胃肠道消化模型。首先建立体外模拟胃肠液的模型,利用体外模拟胃肠道的方法研究RVPSL蛋清寡肽在人体吸收代谢的过程,通过高效液相色谱仪测得RVPSL蛋清寡肽消化代谢量,为进一步研究寡肽的消化代谢研究奠定基础。试验结果表明,在模拟胃环境中,当蛋清寡肽RVPSL代谢量为初始含量的61.40%±3.02%,且其在胃环境中代谢60~90min时,RVPSL代谢率最高;而在模拟肠环境中,蛋清寡肽RVPSL代谢量为初始含量的30.44%±5.82%,且其在肠环境中代谢60~90min时,RVPSL代谢率最高。为了进一步研究蛋清寡肽RVPSL在小肠中吸收代谢的情况,本研究初步建立了Caco-2/HT29细胞共同培养模型。为了优化共培养细胞的接种比例,本研究检测了细胞单层膜的跨上皮电阻值(TEER),并用FITC-Phalloidin将细胞单层膜染色后,用激光共聚焦显微镜观察细胞成膜状态,同时用阿尔新蓝对共培养细胞中的粘液进行染色,最后提取细胞总RNA,用荧光定量Real-time PCR法对不同比例共培养模型中细胞的代表性基因表达量进行分析。综上所述,我们比较系统地评价了不同接种比例的Caco-2/HT29共培养细胞模型,确定了Caco-2:HT29为9:1为共培养细胞的最优接种比例,为后续蛋清寡肽的吸收代谢试验奠定基础。本研究还利用建立的最优细胞共同培养模型研究蛋清寡肽RVPSL的代谢。MTS试验证明蛋清寡肽RVPSL对Caco-2、HT29细胞无生殖毒性,随后在细胞模型的AP侧(嵌入小室的顶端)加入蛋清寡肽RVPSL,利用超高效液相色谱仪在不同时间点检测RVPSL的分解率与代谢率。结果表明在Caco-2/HT29细胞共同培养模型中,RVPSL在0~30min时AP侧测得的分解率最高,在30~60min时BL侧(嵌入小室的基底侧)测得的代谢率最高。以Caco-2/HT29细胞共同培养模型为依托,研究蛋清寡肽RVPSL对细胞模型中细胞因子IL-6和IL-8分泌的影响。在加入不同浓度的RVPSL后2h测定其IL-6、IL-8细胞因子的浓度,测定结果显示浓度大于3m M时能促进细胞因子IL-6的产生,但RVPSL对IL-8细胞因子的产生无促进作用。在加入不同浓度的RVPSL后12h测定其IL-6、IL-8细胞因子浓度,当RVPSL浓度大于5m M时能促进细胞因子IL-6的产生;而RVPSL对IL-8细胞因子均有明显的抑制作用。