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(Ⅰ)CrmG是以5’-磷酸吡哆醛PLP为辅因子的转氨酶,属于Fold-type Ⅰ型天冬氨酸超家族酶类,参与浅蓝霉素A在体内的生化合成反应。据报道,浅蓝霉素A具有显著的免疫抑制剂的生物活性。CrmG基因位于海洋放线菌类异壁放线菌属蓝黑异壁放线菌WH1-2216-6的基因序列,位于青蓝霉素A生物合成的基因簇中。CrmG蛋白全长有523个氨基酸残基,由PLP结合的大的结构域和C端酶催化结构的小域构成。为了了解该酶在体内的催化合成机制,我们对CrmG展开结构生物学研究。我们把该目的基因片段克隆到pET-28a载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,经镍柱层析和分子筛层析纯化后得到纯度在95%以上的蛋白,动态光散射和Native-Page显示蛋白状态均一性良好。通过结晶和X-Ray衍射后我们解析了 CrmG的全长和CrmG与谷氨酸的复合物晶体结构,分辨率在2.3A和1.8A,都属于1222空间群,每个不对称单位含有一个蛋白分子,经PISA分析可得到两个同源二聚体之间相互作用形成了四聚体的结构。整体结构上类似于同家族蛋白的subclass Ⅱ。型构象。野生型蛋白CrmG结构和CrmG与谷氨酸复合物的结构没有发生大的构象变化,而在活性口袋部位的电子密度都不够完整,与前者比较,从Thr202到His208和Ser231到Va1249缺失。分析此结构可能缺失了 1个β-折叠和1-2个α-螺旋,此部分柔性较大,该段序列是否参与了该酶底物的特异性催化或参与该酶二聚体的形成还需要进一步对其PLP结合型的二聚体结构的解析。另外,我们发现该酶氨基酸序列在121-196位上有两个α-螺旋和256-266位的两个β-折叠构成向外伸展的尾巴状结构构象,比对同源家族蛋白序列发现该段序列极不保守,此结构类型在该家族酶类中首次发现,此区域远离活性口袋。酶活性位点定点突变实验证实,将Phe55突变成Gln后没有影响到该酶的活性,而Lys344与PLP的吡啶环上的醛基结合形成Schiff碱构象是该酶活性的基础,把它突变成Ala后酶活丧失,Va1317突变成Ala后,该酶也失去活性,推测可能是缬氨酸残基侧链起到稳定外部亚酰胺中间体的构象作用。(Ⅱ)Sorting nexin7(SNX7)蛋白是SNXs家族蛋白的一员,该家族蛋白在细胞内吞和内体分选运输过程中发挥重要调节作用。SNX7含有PX结构域和BAR结构域,属于SNX-PX-BAR亚家族蛋白。斑马鱼体内实验表明,SNX7是在肝脏中大量表达的抗凋亡蛋白,在胚胎肝脏早期的发育中发挥关键的调节作用。本实验为了从蛋白水平对SNX7的结构和功能进行研究,我们将编码人源SNX7PX-BAR(SNX7全长的一个片段,包含PX结构域序列和BAR结构域序列)的cDNA片段插入到表达载体p28a中,经过扩增后,再将重组质粒转化到大肠杆菌Rosseta2(DE3)中诱导表达,在IPTG诱导下可以得到分子量约为43kDa的融合蛋白。并用镍柱亲和层析、离子交换和分子筛层析对蛋白SNX7PX-BAR进行了纯化,得到纯度在95%以上的蛋白。Western-Blotting结果表明,经过纯化后获得了高纯度的SNX7PX-BAR蛋白。动态光散射实验显示SNX7PX-BAR蛋白均一性良好。磷脂结合实验表明,SNX7PX-BAR具有较为广泛的磷脂酰肌醇结合能力,与PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2 和 PtdIns(3,4,5)P3 的结合能力相对较强,而与 PtdIns(4)P的结合能力较弱。到目前为止,还未得到SNX7PX-BAR蛋白的晶体,为了得到该蛋白的结构,相关工作还需进一步的开展。