原始生殖细胞(Primordial germ cells,简称PGCs)是精子或卵子的前体细胞,PGCs细胞具有发育的全能性,任何一个细胞都具有发育成一个完整个体的潜能,在体外PGCs可诱导分化出包括三个胚层在内的所有分化细胞,PGCs也具有种系传递功能,能与另一个正常胚胎嵌合,获得包括生殖系在内的动物个体。本研究采用鹌鹑为研究对象,以鸡成纤维细胞饲养层及各种生长因子为基础,对5.5天鹌鹑胚胎PGCs的分离、纯化、培养进行了研究,并对鹌鹑的PGCs的冷冻保存效果进行了探讨。1.鸡成纤维细胞饲养层的制作:采用孵化6天的海兰白种鸡蛋为实验材料,经培养传至2-3代后,以丝裂霉素-C处理后所得到的细胞单层作为饲养层。2.PGCs的分离及鉴定:本实验采用孵化5.5天的鹌鹑胚胎,以酶解法消化获得细胞。对其消化时间做了探讨,发现消化15分钟所获得的细胞数最多。每枚性腺获得的细胞平均为226个左右,并分别用形态学和碱性磷酸酶(AKP)对PGCs做了鉴定。3.PGCs的传代及培养:分别在无饲养层,无生长因子的培养液中、鸡成纤维饲养层及添加LIF＼SCF＼bFGF的鸡成纤维饲养层上对PGCs进行培养。在不含饲养层和生长因子的饲养层中培养原始生殖细胞,基质细胞成纤维状贴壁生长,培养的时间很短,不超过5-6天。原始生殖细胞置放在鸡胚成纤维细胞饲养成上时,细胞的分化得到了有效的抑制,前2天原始生殖细胞仍保持单个的未分化状态。在培养3天后分化的程度比之无饲养层的PGCs情况好,PGCs存活50%左右。在添加生长因子的成纤维细胞饲养层中培养,前3天左右细胞基本不出现分化,保持单个的未分化状态,在4-5天后细胞开始出现分化,PGCs存活76%左右,培养至第6-7天后,细胞出现7-8个细胞的细胞克隆;培养至第10天时,细胞团细胞达到13-15个左右,此时细胞形态不明显,细胞间的结合不紧密,成纤维细胞大量死亡。本实验尝试在第7天进行鹌鹑原始生殖细胞的传代,对于鹌鹑PGCs的传至第5代,细胞仍具有原始生殖细胞的形态,部分细胞保持分裂增殖能力。4.PGCs的冷冻与解冻:解冻保存了2个月的原始生殖细胞。方法1(DMSO作为冷冻液)解冻后细胞存活率为61.4%,方法2(EG+PVP作为冷冻液)解冻后细胞存活率为54.2%(P＞0.05)。以上结果表明:以酶解法在5.5天鹌鹑性腺中分离到PGCs,将PGCs在添加生长因子的鸡成纤维细胞上培养,在第7天对鹌鹑PGCs进行传代,传至5代仍有部分细胞存活并具有分裂增殖的潜能。解冻保存2个月的鹌鹑PGCs,获得了较高的成活率,并具有PGCs的形态。PGCs系的建立可为研究生殖细胞的发育机制和生殖系瘤化提供丰富的实验材料,PGCs也是将目的基因直接传给后代的理想载体,作为载体转基因有着诱人的前景。