机体及其细胞经常受到各种环境因子的作用。环境中存在着物理、化学和生物等不同因子，它们引起机体和细胞的反应特点，一方面受制于机体固有遗传结构的进化发育阶段和功能状态，另一方面取决于环境因子的性质和剂量。随着工业的发展，环境化学因子日益增多，其对健康的影响受到关注。近年来，高浓度接触所致急性中毒和损伤在人们的努力下已大为减少，而代之低浓度，甚至是极低浓度的接触，这些接触和高浓度接触在健康效应上有着什么样的区别；在进行危险度评定和管理中应采取什么样的策略；在保护环境和人体健康的前提下，如何更好地促进化学工业的发展；是人们更为关心的问题。所以，低水平的环境化学因子诱导机体产生的生物学效应和机制及其对人类健康评定的影响成为目前毒理学领域研究的热点。本研究建立了ECPs包括过氧化氢(H2O2)、甲醛(FA)、三氯乙烯(TCE)、氢醌(HQ)诱导细胞适应性反应的模型，并用荧光差异显示PCR技术寻找不同处理差异表达的基因，通过进一步的鉴定和验证，为探讨低剂量的ECPs诱导细胞适应性反应的机制提供科学依据。 方法：1ECPs诱导细胞适应性反应模型的建立 用一系列剂量的H2O2对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)进行染毒，MTT法获得H2O2对细胞毒性的剂量效应关系和时间效应关系。选择对细胞没有损伤或者有增殖效应的剂量为低剂量，对细胞有明显损伤效应的剂量为高剂量，然后用低剂量的毒物预刺激细胞一定的时间后，继而用大剂量的同一毒物攻击，观察细胞的损伤效应，将低剂量预刺激后可以减轻继而大剂量攻击的损伤效应的一组剂量作为适应型反应模型的剂量。用乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)、Annexinv/PI检测细胞凋亡来验证H2O2诱导MRC-5适应性反应的模型。FA、TCE、HQ的剂量效应关系及其适应性反应模型的建立由课题组的其他科研人员进行。 2荧光差异显示PCR寻找不同处理组差异表达的基因 H2O2、FA、TCE、HQ分别对细胞进行染毒，按：对照组、低剂量组、高剂量组，适应性反应组处理细胞，在各组细胞染毒终止后，提取细胞总RNA，用无RNA酶的DNA酶清除污染的DNA，紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分别检测其纯度和完整性。优化荧光差异显示PCR的锚定引物(APs)和随机引物(ARPs)，然后用APs进行逆转录(RT)反应，合成cDNA，再用优化的APs和ARPs组合，进行荧光差异显示PCR，最后进行5.6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过GenomyxSC扫描系统扫描，用系统所带的AcquireSC软件进行定位，分离差异表达的基因。 3差异条带的再扩增、克隆、鉴定、测序及同源性比较 选择感兴趣的差异条带进行再扩增，电泳鉴定后，克隆到pGEM-T载体，对阳性重组菌通过菌落PCR鉴定，测序。然后将获得的序列和NCBI上提供的包括GeneBank+EMBL+DDBJ+PBD的核酸序列数据库BLAST，进行同源性分析。4用荧光定量PCR方法验证目的基因是否差异表达 将H2O2处理的各组细胞的总RNA进行常规RT，然后以cDNA为模板，根据条带的测序结果按荧光定量PCR要求设计引物，采用SYBRGreenⅠ荧光染料相对定量的方法检测基因的表达。以β-actin为内参，通过目的基因和内参的标准曲线来保证两者的扩增效率相同，以便相对定量。熔解曲线消除引物二聚体对结果的影响。然后进行相对定量验证所得目的基因是否差异表达。 结果1ECPs诱导细胞适应性反应模型的建立 用0、0.088、0.88、8.8、88、880、1100、2200、4400、8800μmol/L的H2O2对MRC-5细胞染毒6h，通过MTT法获得对MRC-5毒性的剂量效应关系，发现0.088-88μmol/L范围内的H2O2对细胞几乎没有损伤(P＞0.05)；从880μmol/L开始，H2O2对细胞有明显损伤(P＜0.05)。然后进行H2O2对MRC-5时间效应关系的分析，发现H2O2对细胞染毒1～24h，其毒性没有显著的变化(P＞0.05)。所以将0.088、0.88、8.8、88μmol/L作为低剂量，预刺激细胞24h后，然后把1100μmol/L作为高剂量刺激细胞1h。观察发现用0.088、0.88、8.8μmol/L的H2O2预刺激细胞后，继而用1100μmol/L的H2O2攻击，细胞的损伤明显较直接用1100μmol/L刺激的损伤轻，而且0.88μmol/L预刺激后这种效果更为明显，故将0.88μmol/L预刺激细胞24h，1100μmol/L攻击1h作为H2O2诱导MRC-5适应性反应的模型。 乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)的检测：将细胞按对照组、低剂量组、高剂量组、适应性反应组处理后，检测LDH漏出率，发现对照组和低剂量组LDH的漏出率差别很小，统计学上没有显著差异(P＞0.05)；而高剂量组LDH的漏出率和对照组比较，显著增高(P＜0.05)；适应性反应组LDH的漏出率比高剂量组明显下降，但是还未能够恢复到对照组的水平。 Annexinv/PI检测细胞凋亡：同上述处理细胞后检测凋亡，发现：低剂量与对照组比较，活细胞数相对少一些(P＞0.05)，死细胞数和凋亡细胞数相对多一些(P＞0.05)；而高剂量组和对照组比较，活细胞数明显减少(P＜0.05)，死细胞数增多(P＜0.05)，而凋亡细胞数变化不大(P＞0.05)；适应性反应组的活细胞数与高剂量组比较有所增多，死细胞数减少，凋亡细胞数略有增多。 乳酸脱氢酶漏出率(LDH％)的检测和Annexinv/PI检测细胞凋亡的结果都验证了通过MTT法所获得的适应性反应的模型。 FA、TCE、HQ的剂量效应关系及适应性反应模型的剂量参照课题组的试验结果。 2荧光差异显示PCR寻找差异表达的条带 以H2O2、FA、TCE、HQ不同处理组的细胞总RNA用特定APs逆转录的cDNA为模板，选择优化的APs和ARPs组合，进行荧光差异显示PCR，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过荧光扫描、定位获得差异条带。将低剂量组、高剂量组、适应性反应组与对照组比较：H2O2有60个差异条带、FA有61个，TCE有52个，HQ有33个。 3差异条带的再扩增、克隆、鉴定、测序及同源性比较 选择差异比较明显的条带进行二次PCR，然后通过进一步克隆、测序、同源性比较发现： H2O2的15个再扩增的条带中，有8个新基因，7个已知基因； FA的11个再扩增的条带中，有9个新基因，2个已知基因； HQ的8个再扩增的条带中，有7个新基因，1个已知基因。 4用荧光定量PCR进行差异条带的验证 将H2O2部分差异条带(H8，H18，H21，H30，H34)采用SYBRgreenⅠ荧光染料进行相对定量，目的基因和内参的标准曲线表明扩增效率均在90～110％，熔解曲线均为单峰曲线，消除了引物二聚体对结果的影响。实验结果表明各个片断表达的差异均和荧光差异显示PCR结果一致。 结论1本研究采用了传统差异显示PCR的改良技术——荧光标记差异显示PCR法，在引物设计、PCR条件、凝胶浓度、电泳条件以及标记物等方面有所改进，极大地减少了传统该方法的不足，也大大降低了该方法的假阳性率。 2成功建立了H2O2诱导MRC-5的适应性反应的模型，并通过荧光差异显示PCR，找到ECPs诱导机体适应性反应过程中差异表达的基因，将这些基因进行克隆，测序，同源性比较，最后通过荧光定量PCR验证基因表达的差异。 3四种毒物诱导机体适应性反应差异表达基因结果表明低剂量的ECPs诱导适应性反应的机制有以下几个方面：1)维持细胞稳态的蛋白的参与：如核糖体蛋白S15a、核糖体蛋白S10、LAMP2、MRPL47、凋亡相关转录因子1(BCLAF1)；2)抗氧化系统的参与：如SOD1；3)DNA损伤修复系统的参与：NADH脱氢酶铁硫蛋白4(NDUFS4)、NF-kB激活激酶等；4)激活细胞信号分子：如NF-kB-激活激酶、Rap1相关因子RIF1等。 4对这些基因进一步的功能研究将为ECPs诱导机体损伤耐受的机制及其制定ECPs的防治策略提供科学依据。