槐耳是一种药用真菌,1600多年前即开始在中国用于抗癌治疗,其菌质发酵后的热水提取物为槐耳清膏。槐耳具有抗肿瘤活性,可以抑制血管及肿瘤形成、抗肿瘤耐药、抑制癌转移、激活免疫系统以及诱导凋亡等。槐耳主要通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡而发挥其抗肝癌的作用,但具体通过什么凋亡途径、作用的具体靶点、凋亡调控机制等尚未得到深入研究。近些年自噬研究成为热点。自噬(Autophagy)是一种进化非常保守的生理过程,在应激、饥饿、缺氧以及生长因子缺乏条件下,细胞降解其自身的细胞质和细胞器而产生营养成分、生长因子以及能量来支持细胞的生存以及活性,是一种实行―自我消化‖的一系列生化过程。在肝癌的发生与发展过程中,自噬可以起到促进和抑制的双重作用。凋亡与自噬之间存在相互联系,自噬可以抑制细胞凋亡,促进细胞生存、增殖,但自噬本身也会触发细胞凋亡或诱发细胞死亡,在与凋亡协同作用下或在凋亡缺陷的情况下独自诱导细胞死亡。目前在槐耳抑制肝癌细胞机制研究中,尚未发现有关自噬的报道,自噬起到什么作用、其与凋亡的关系仍然不明,值得我们进行探究。肿瘤的形成与发展与信号通路密切相关。在与肝癌相关的信号通路中,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在肝癌的发生发展中起到非常重要的作用。MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要包括胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal-regulated protein kinases,ERK),C-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK),和p38激酶(p38MAPK)。MAPK可以通过调节B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)家族蛋白调节下游基因的表达,从而参与几乎所有的细胞病理、生理过程,包括细胞周期调控、细胞存活与死亡、基因表达、细胞运动等。而mapk信号通路也可以通过bcl-2家族蛋白参与对自噬的调控,p38mapk可以对自噬发挥促进和抑制双重作用;jnk与erk则能够促进细胞自噬。因而在本实验中,我们对mapk信号通路在槐耳抑制肝癌细胞过程中所起到的作用进行了较为深入的研究。bcl-2家族蛋白是机体清理异常细胞的关键调节因子。在细胞凋亡信号刺激下,抗凋亡和促凋亡的bcl-2家族蛋白之间的平衡以及相互作用影响下游促凋亡蛋白bax和bak的激活。在激活状态下,bak和bax的构象发生改变并穿透线粒体外膜导致细胞死亡。目前除了已经明确bcl-2可以阻抑线粒体外膜的渗透性,阻止细胞色素c和其他能够激活蛋白酶和caspase的促凋亡蛋白的释放外,bcl-2家族蛋白调节线粒体凋亡的机制仍未完全研究清楚。本研究采用流式细胞分析、mtt、凋亡及自噬相关抑制剂应用、免疫荧光、westernblot等方法,观察肝癌细胞hepg2及huh7在槐耳处理后的增殖和凋亡的变化;检测槐耳对凋亡相关蛋白包括caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及mapk信号通路蛋白、akt/mtor信号通路蛋白以及自噬相关蛋白表达的影响;采用凋亡抑制剂、自噬诱导或抑制剂后观察肝癌细胞增殖及凋亡变化,同时检测caspase3、parp、survivin、bcl-2家族蛋白以及自噬相关蛋白表达,研究槐耳对肝癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响,探讨其诱导、调控肝癌细胞凋亡及自噬的相关机制,为槐耳治疗肝癌提供理论依据和实验基础。第一部分槐耳抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡目的:观察槐耳对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,并检测相关标志蛋白,明确槐耳诱导肝癌细胞凋亡的具体途径。方法:mtt及单细胞克隆形成实验检测槐耳对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡及周期分布,hoechst33258染色观测肝癌细胞凋亡小体,应用全凋亡抑制剂z-vad-fmk观察肝癌细胞凋亡变化,验证槐耳诱导凋亡。westernblot检测周期及凋亡相关蛋白cyclind1、caspase3/8/9、parp、survivin、p53、bcl-2家族蛋白,明确槐耳诱导凋亡的具体途径。结果:槐耳明显抑制hepg2、huh7增殖,并呈时间、浓度依赖性,药物作用时间延长,浓度增加,细胞存活率随之降低。流式细胞术检测结果显示随着槐耳浓度的增加,细胞增殖周期阻滞效果越明显,周期分布呈现浓度依赖性。周期相关蛋白cyclind1及cdk2在槐耳作用后表达显著下降。在hepg2及huh7细胞中,槐耳处理细胞后细胞凋亡率显著上升,明显高于对照组,相应的parp、caspase3、8、9出现裂解,表达量显著增加。bcl-2家族蛋白中bcl-2、bcl-xl及mcl-1表达均显著降低,而bim、bax表达均显著升高,同时抑癌蛋白p53表达显著升高。survivin在两种细胞中表达均显著下降。在应用z-vad-fmk后,槐耳对肝癌细胞增殖的抑制显著减弱,细胞增殖能力显著回升,凋亡水平显著下降。而相应的槐耳联合z-vad-fmk作用后caspase3及parp蛋白表达量较槐耳组显著下降。结论:槐耳能够阻滞肝癌细胞由g1期进入s期,并抑制cyclind1的表达,与此同时还能够诱导肝癌细胞发生凋亡,并使bcl-2家族抑凋亡蛋白表达降低,促凋亡蛋白表达升高。槐耳还能使survivin表达降低,并提高了p53的表达。槐耳可能是通过同时激活内外源凋亡途径来诱导肝癌细胞发生凋亡。第二部分p38mapk信号通路调控槐耳诱导的肝癌细胞凋亡目的:槐耳诱导肝癌细胞凋亡的具体调控机制。方法:westernblot检测mapk信号通路变化;应用mapk信号通路抑制剂后,通过mtt及流式细胞术观察其对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,westernblot检测凋亡标志性蛋白改变,明确主要调控通路;同时检测bcl-2家族蛋白、survivin在mapk抑制剂作用下表达的改变。结果:槐耳作用于hepg2及huh7细胞后,mapk三条主要途径均活化。erk及jnk在两种细胞中4小时内即显著活化,但随槐耳作用时间延长jnk及erk表达逐渐下降;p38mapk在两种细胞中活化最为显著。p38mapk抑制剂显著减弱槐耳对肝癌细胞的抑制作用。在hepg2及huh7细胞中,p38mapk抑制剂可以使肝癌细胞凋亡率显著下降,jnk及erk抑制剂则对肝癌细胞凋亡影响较小。mtt及克隆形成结果显示p38mapk抑制剂能够显著提高肝癌细胞的增殖能力,而erk及jnk抑制剂则未能产生显著影响。相应的p38mapk抑制剂作用后cleavedcaspase3及parp表达显著下降,jnk抑制剂作用后蛋白表达无显著变化,erk抑制剂作用后cleavedcaspase3及parp表达均显著上升。p38mapk抑制剂显著影响bcl-2家族蛋白及survivin表达。在hepg2及huh7细胞中,加入p38mapk抑制剂后,bcl-2及survivin表达显著回升,而bax则显著下降;jnk抑制剂作用后bcl-2、survivin表达均提高,但bax表达变化不同;erk抑制剂作用后bax表达上升,而bcl-2及survivin表达则下降。结论:mapk三条途径在槐耳作用后均活化,其中p38mapk最为显著。槐耳诱导肝癌细胞凋亡可能是主要通过p38mapk信号通路调节survivin及bcl-2家族蛋白来实现的。survivin能够减弱槐耳对肝癌细胞的抑制效果,联合p38mapk抑制剂后能够进一步减弱槐耳的抗癌作用。survivin可能是p38mapk潜在的靶蛋白。第三部分p38mapk信号通路参与调节槐耳诱导的肝癌细胞凋亡及自噬目的:观察槐耳能否诱导肝癌细胞发生自噬,明确自噬对肝癌细胞凋亡的影响,研究mapk信号通路对肝癌细胞自噬的影响及其调控机制。方法:westernblot检测自噬标志性蛋白及akt/mtor信号通路蛋白,电镜观察自噬体形成;应用自噬抑制剂及诱导剂后mtt及流式细胞术观察自噬对肝癌细胞增殖及凋亡的影响;mapk抑制剂作用后观察肝癌细胞自噬变化,明确调控机制。结果:槐耳能够诱导肝癌细胞发生自噬,并抑制akt/mtor信号通路。p62表达量随着槐耳作用时间的延长显著下降,beclin1表达量和lc3ii/lc3i比值则显著提高。而自噬上游相关蛋白akt、mtor及p70s6k在hepg2及huh7中表达均显著下降。自噬显著影响肝癌细胞的凋亡。在hepg2及huh7细胞中,rapamycin可以显著降低槐耳诱导的肝癌细胞凋亡率;而应用cq则使细胞凋亡略升高,但与槐耳组相比凋亡率变化无统计学意义。mtt检测显示rapamycin处理肝癌细胞后,细胞增殖能力较槐耳组显著提高,而cq作用后,细胞增殖率显著下降。hepg2及huh7细胞在rapamycin处理后,cleavedcaspase3表达较槐耳组明显减少,而parp在rapamycin作用下有所减少;cq作用后,cleavedcaspase3表达水平显著提高,而parp表达量较槐耳组无显著差异。p38mapk及jnk参与调节槐耳诱导的肝癌细胞自噬。在hepg2及huh7细胞中,与对照组相比,p38mapk抑制剂作用后,细胞自噬显著增强,beclin1表达及LC3 II/LC3 I比值显著提高,而p62表达显著下降;JNK抑制剂则使Beclin 1表达及LC3 II/LC3 I比值下降,p62表达升高;ERK抑制剂则对肝癌细胞自噬水平无显著影响,Beclin 1、p62及LC3表达均未发生显著改变。免疫荧光结果显示在Hep G2及Huh7细胞中,p38MAPK抑制剂可以使细胞中LC3显著增多,而JNK抑制剂作用后LC3则显著减少,ERK抑制剂对LC3无显著影响。结论:槐耳能够诱导肝癌细胞发生自噬。自噬在槐耳抑制肝癌细胞过程中起到保护肝癌细胞的作用,能够抑制肝癌细胞的凋亡。p38MAPK信号通路参与了槐耳诱导的肝癌细胞自噬,并可能起到抑制自噬的作用。