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目的研究Fen对SH-SY5Y细胞活力、早期细胞凋亡及氧化应激水平的影响。方法Fen作用于体外培养的SH-SY5Y细胞,观察细胞生长形态,采用MTT法检测细胞活力；FITC-Annexin V/PI染色,流式细胞术检测细胞凋亡水平；JC-1染色后通过流式细胞仪检测线粒体膜电位；DCFH-DA染色后使用流式细胞仪检测细胞氧化应激水平；采用蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测Fen对凋亡相关蛋白Caspase-3, bcl-2表达水平的影响。结果倒置显微镜观察显示,Fen处理SH-SY5Y细胞后,引起细胞生长缓慢,胞浆减少,突起变长,胞浆中存在颗粒物聚集。MTT检测显示：Fen可以浓度依赖性和时间依赖性的引起细胞活力下降。流式细胞术检测结果显示：Fen可以浓度依赖性和时间依赖性的诱发细胞凋亡、时间依赖性的引起线粒体膜电位下降及氧化应激反应增强。Western Blot检测进一步证实Fen可以诱发细胞凋亡,凋亡相关蛋白Caspase-3活化,伴有bcl-2表达呈浓度依赖性的下降。结论Fen可以诱发拟多巴胺能神经细胞SH-SY5Y细胞活力下降,引起细胞凋亡及增强氧化应激反应,在该细胞模型中模拟了帕金森病的部分病理过程。目的研究Fen对α-synuclein、泛素以及P62表达、定位及聚集状态的影响方法Fen处理SH-SY5Y细胞后,采用HE染色观察细胞内胞浆包涵体；使用α-synuclein、泛素以及P62特异性抗体染色,激光共聚焦显微镜观察Fen对α-synuclein、泛素以及P62的定位及聚集状态的影响；Western blot检测细胞中α-synuclein和泛素的表达水平。结果H-E染色显示,Fen可以诱导SH-SY5Y细胞胞浆中出现嗜伊红的包涵体。进一步行α-synuclein、泛素以及P62染色后,激光共聚焦显微镜观察发现Fen使得细胞胞浆中a-synuclein、泛素以及P62颗粒样聚集物增多。Western blot检测发现Fen可以浓度依赖性的增加a-synuclein和泛素表达。结论Fen可以诱发体外培养的SH-SY5Y细胞产生嗜酸性包涵体,并可以增加Lewy小体的主要成分a-synuclein、泛素以及P62的表达和颗粒样聚集物形成,模拟了PD中蛋白质异常聚集的特点。目的探明Fen引起蛋白质异常聚集的可能原因方法Fen作用于体外培养的SH-SY5Y细胞,Western blot检测LC3及P62的表达；激光共聚焦显微镜观察有无自噬小体形成；使用雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤分别预处理细胞后,观察对Fen诱导的自噬水平及蛋白质聚集的影响。结果Western blot检测显示Fen可以增加LC3-Ⅱ/LC-Ⅰ的比值,但该比值早期增高明显,呈时间依赖性的下降,同时可以时间依赖性的增加P62的表达。激光共聚焦显微镜观察显示,Fen可以引起胞浆中LC3染色阳性的颗粒样聚集物增多,提示自噬体形成。使用雷帕霉素激活自噬后可以降低Fen引起的a-synuclein、P62及泛素表达水平。结论自噬溶酶体途径功能异常可能参与了Fen对SH-SY5Y细胞的毒性作用,激活自噬可以减轻毒性作用。目的观察腹腔注射Fen及联合DA立体定向注射对C57BL小鼠黑质纹状体多巴胺能神经通路的影响方法采用分别单独腹腔注射Fen、纹状体立体定向注射DA以及两者联合使用建立C57BL小鼠模型,使用爬竿实验和直立实验观察小鼠行为学变化；高效液相色谱检测脑组织总Fen含量；TH染色后,使用激光共聚焦显微镜观察黑质多巴胺能神经元及纹状体；激光共聚焦显微镜观察黑质区神经元DAT的表达。结果Fen、DA分别及共同作用七天都将引起小鼠自主活动减少。高效液相色谱检测到腹腔注射Fen的小鼠脑组织中有Fen残留,并与外周给药浓度正相关。激光共聚焦纤维镜观察显示：Fen和DA两种毒素作用七天可以引起黑质区多巴胺能神经元TH表达不均一,纹状体TH染色出现斑片状丢失,以两者联合使用七天组最明显；并且Fen单独或与DA共同暴露七天都将引起黑质区DAT表达增高。结论Fen可以透过血脑屏障,引起C57BL小鼠黑质纹状体多巴胺能系统改变,与DA共同作用时可以明显增强该反应。目的观察长期慢性Fen暴露及Fen黑质立体定向注射对SD大鼠黑质纹状体多巴胺能神经通路的影响方法采用连续腹腔注射Fen2月及单次黑质区立体定向注射Fen动物模型。选择全身给药组末次给药后次日及末次给药后2月、立体定向注射为单次注射后2月为实验终止时间。使用跨步试验、探索实验和阿扑吗啡诱导的旋转试验观察大鼠行为学变化；TH染色计数黑质区TH阳性细胞数目及观察黑质区及纹状体区TH免疫原性；激光共聚焦显微镜观察黑质区神经元DAT、VMAT及泛素表达；酶标仪检测Fen作用后不同脑区MDA水平、SOD及GSH酶活性。结果Fen腹腔注射可以减少动物自主活动；阿扑吗啡可以诱导Fen立体定向注射的大鼠出现旋转行为；免疫染色结果显示,Fen慢性腹腔注射模型及立体定向注射模型均可出现黑质区TH免疫活性下降,伴有DAT表达上调及VMAT2表达下降,同时Fen腹腔注射慢性模型中黑质区有泛素免疫活性增强。此外,Fen腹腔注射模型中还可观察到肺泡及肝窦扩张等外周器官毒性,而立体定向注射组未观察到。结论Fen慢性暴露可以在大鼠模型中模拟部分帕金森病发病特点。