宫颈癌是发展中国家及地区女性发病率排名第二,致死率排名第三的恶性肿瘤。据我国2015年肿瘤登记年报,我国宫颈癌近10年来的发病率呈明显上升趋势,宫颈癌已成为45岁以下女性的第二位恶性肿瘤,仅次于乳腺癌。由于宫颈癌筛查技术的开展及HPV疫苗的推广应用,使宫颈癌及癌前病变得以早期发现及治疗,但近年来宫颈癌有年轻化趋势。目前,宫颈癌成为我国女性健康的重大问题。目前,高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌的主要病因,但并不是所有的高危型HPV感染者最终都发展成了宫颈癌,上述现象提示可能存在协同因素的共同作用促使宫颈癌的发生。多项研究表明,雌激素受体-α(estrogen receptor-α/ER-α)介导的 17 β-雌二醇(17β-estradiol,E2)参与了高危型HPV感染所致的宫颈癌发生发展过程,而不仅仅是协同作用。然而,ER-α的亚型种类繁多,ER-α介导的雌二醇在宫颈癌中的作用机制仍不明确。ER-α是ESR1基因的转录产物。已知ESR1可转录ER-α的三种亚型:ER-α 66,ER-α 46和ER-α 36。不同于传统的ER-α 66,ER-α 36广泛存在于多种组织的细胞膜和细胞质中,参与多种蛋白激酶的激活及磷酸化,通过瀑布式激活下游信号传导通路,介导快速“非基因效应”信号途径。ER-α 36可能影响细胞的侵袭能力、迁移能力,同时影响细胞的增殖能力,从而影响肿瘤的发生及转移潜能。目前,越来越多的证据表明ER-α 36在某些恶性肿瘤的发生发展过程中发挥一定作用,ER-α36有望成为判断乳腺癌、子宫内膜癌、胃癌等恶性肿瘤预后的新指标。宫颈组织作为富雌激素受体组织,目前却鲜有关于ER-α 36与宫颈癌的相关性的研究。本文旨在探讨ER-α 36在宫颈癌组织及宫颈癌细胞中的表达情况,以及ER-α 36对宫颈癌生物学行为的影响及其机制,为宫颈癌治疗方式的研究提供新思路,为以新型雌激素受体ER-α 36为靶点的药物研究提供理论依据。第一部分雌激素受体ER-α 36在宫颈癌中的表达研究目的:检测ER-α 36在人宫颈癌组织及宫颈癌细胞系中的表达水平。研究方法:使用组织免疫化学方法检测ER-α 36在8例人类正常宫颈组织及40例人类宫颈癌组织中的表达。培养HPV16(+)Caski细胞株,HPV18(+)Hela细胞株。使用细胞免疫荧光染色检测ER-α 36在宫颈癌细胞系中的表达定位。研究结果:1.ER-α 36在正常宫颈组织和宫颈癌组织中均有表达,表达强度存在明显差异。免疫组化结果显示,ER-α 36表达于正常宫颈组织及癌组织的细胞膜及胞质中,细胞核中无表达,其阳性表现为棕色、棕黄色、黄色染色,表达强度存在明显差异。在正常宫颈组织中,ER-α 36的表达率为75%(6/8),其中高表达率为12.5%(1/8);宫颈癌组织中的表达率为90%(36/40)。ER-α 36在宫颈鳞癌中的表达强度显著高于正常宫颈组织,具有统计学差异(P<0.05)。2.ER-α 36在宫颈癌细胞系中表达。为检测ER-α 36在细胞水平的表达情况,我们使用细胞免疫荧光,检测其在宫颈癌细胞株CaSki和HeLa细胞株中的表达。结果显示,ER-α36在两种细胞系中均有表达,主要表达于细胞膜及细胞质,细胞核中无表达。研究结论:1.ER-α 36表达于正常宫颈组织和宫颈癌组织的细胞膜和胞质,细胞核无表达;ER-α 36在宫颈鳞癌中的表达强度显著高于正常宫颈组织,提示ER-α 36可能与协同因素共同作用促进了宫颈癌的发生发展。第二部分雌激素受体ER-α 36的表达对宫颈癌生物学行为影响及相关机制研究研究目的:建立稳定ER-α 36高表达及稳定ER-α 36低表达宫颈癌细胞株,在体外实验中探究ER-α 36的表达对宫颈癌细胞迁移、侵袭、增殖等生物学行为的影响及可能其参与的信号通路。研究方法:1.通过慢病毒转染宫颈癌HPV16(+)Caski细胞株,HPV18(+)Hela细胞株,构建ER-α 36高表达/低表达稳转细胞系。通过观察细胞荧光表达、实时荧光定量PCR技术及Western blot确认ER-α 36转染效率后进行后续实验。使用嘌呤霉素筛选出成功感染的细胞;使用细胞划痕实验,测定细胞的水平迁移能力;Transwell小室检测细胞的侵袭能力;EdU实验测定细胞的增殖能力;Western blot检测各细胞株用药物处理前后,ER-α 36表达水平和信号通路蛋白的活化情况。2.统计学分析:本研究全部实验重复3次及3次以上,计量资料结果以均数±标准差SD呈现,结果使用单因素方差分析或Student’ s t检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.ER-α 36高表达/低表达稳转细胞系的建立:(1)通过观察GFP的表达时间和表达强度,确定慢病毒对目的细胞的感染情况。对于CaSki及HeLa细胞系,在感染约72h后用荧光显微镜观察,发现荧光表达丰度较高,感染效率接近100%。(2)使用“CTGGCTAGAGATCCTGATGAT”shRNA序列作为后续实验的干扰序列,用包含人类ER-α 36序列的慢病毒转染宫颈癌细胞株,建立ER-α 36稳定高表达细胞株。2.敲减ER-α 36可有效抑制细胞迁移、侵袭及增殖能力:(1)Westernblot方法检测两种宫颈癌细胞系中ER-α36的敲减效率:在转染后约72小时,分别提取细胞总蛋白,结果显示CaSki细胞系中ER-α 36的表达降至原表达水平的30%,HeLa细胞系中ER-α 36的表达降至原表达水平的60%。(2)Transwell实验检测敲减ER-α 36对宫颈癌细胞体外侵袭能力的影响。CaSki和Hela细胞在沉默ER-α 36基因后,穿过聚碳酸酯膜的细胞数远远少于阴性对照组(P<0.05)。(3)划痕实验检测敲减ER-α 36后对两种细胞系迁移能力的影响。在24h及48h两个时间点对迁移至划痕区域细胞进行拍照。结果显示,在上述两个时间点,CaSki/RNAi细胞株的迁移能力同对照组相比均明显降低,而HeLa/RNAi细胞株仅在48h时表现出迁移能力的降低(P<0.05)。(4)EDU结果显示,LV-RNAi细胞株中EdU阳性(红色)的细胞所占比例较对照组相比显著减少(P<0.01),提示其增殖能力显著降低。3.ER-α 36过表达提高宫颈癌细胞系的侵袭,迁移及增殖能力:(1)Western blot方法检测两种宫颈癌细胞系中ER-α 36的上调效率:ER-α 36的表达均增高了 60%以上。(2)Transwell实验结果显示,ER-α 36表达水平上调后,CaSki/ER-α 36细胞系及HeLa/ER-α 36细胞系穿过聚碳酸酯膜的细胞数远多于阴性对照(P<0.05)(3)划痕实验结果显示,在24h时,同对照组相比,ER-α 36过表达细胞株的迁移速度均未表现出明显提升,在48h时,其迁移速度显著高于对照组。(p<0.05)。(4)EDU结果显示,高表达ER-α 36组的细胞增殖率显著高于对照组(P<0.05)。4.ER-α 36对宫颈癌生物学行为的影响由MAPK/ERK通路介导:(1)用E2处理CaSki及HeLa细胞系不同时间,发现ERK1/2快速磷酸化在5-1 0min时达到峰值,而总ERK1/2蛋白量却并未改变,提示p-ERK1/2在第5-10min的升高并非是由于总ERK1/2蛋白量改变导致的。(2)对于LV-RNAi细胞株,E2的刺激并未造成p-ERK1/2的变化,说明E2可能通过ER-α36发挥效应。(3)用E2处理ER-α36高表达细胞系,p-ERK1/2峰值出现在第3-10min,总ERK1/2蛋白量亦未发生改变。(4)用E2及MEK特异性抑制剂U0126先后处理CaSki及HeLa细胞系,发现U0126可有效抑制E2引起的ERK1/2快速磷酸化。研究结论:1.ER-α 36参与了宫颈癌细胞迁移、侵袭及增殖等恶性生物学行为,可能在宫颈癌发生及发展过程中起重要作用。2.ER-α 36通过介导雌激素刺激下MAPK/ERK信号通路的激活影响宫颈癌细胞的生物学行为。