1、目的与意义慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic costritis, CAG)是一种由多种因素引发的、以胃黏膜腺体萎缩为特征的一种临床常见消化系统疾病,发病率占全部慢性胃炎的10%-20%,同时研究表明CAG具有2.55%-7.46%的癌变率,世界卫生组织(WHO)已将慢性萎缩性胃炎定义为癌前状态。因此,对慢性萎缩性胃炎的积极治疗,阻断病程向胃癌发展具有重要的临床意义。迄今为止,现代医学对CAG无特异性治疗药物,临床上常采用促上皮细胞生长和促胃肠蠕动药物以根除幽门螺杆菌感染；以及补充铁和维生素B12等方法治疗CAG,这些治疗方法虽能在一定程度上减轻症状,但均无法从根本上逆转胃粘膜的萎缩及由此引发的胃功能损伤。中医药在治疗难治性疾病上以其独特治疗方法取得显著的临床疗效,中医将CAG归为胃脘痛、呃逆、痞满等范畴,以益气健脾、活血化瘀、疏肝理气、清热解毒药物治疗取得较好的临床效果。因此,从临床治疗CAG有效中药及天然药物中寻找和发现有效的活性成分,是研制抗CAG药物的有效途径之一。甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)为豆科类植物甘草的根及根状茎,具有补脾益气、清热解毒、缓急止痛等功效,其主要活性成分甘草总黄酮具有多种药理学作用。现代药理学研究表明,甘草总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛等多种作用。我们前期研究证明：甘草总黄酮对慢性浅表性胃炎大鼠胃粘膜损伤有显著的保护和修复作用；同时,能够抑制浅表性胃炎大鼠血清促炎因子的释放,有显著的抗炎镇痛作用。甘草总黄酮对浅表性胃炎胃粘膜损伤具有保护和修复作用,是否对慢性萎缩性胃炎也有这种作用尚未见报道。因此本项研究采用萎缩性胃炎大鼠模型,探讨和评价甘草总黄酮对CAG大鼠胃粘膜损伤的保护和修复作用,并探讨其相关药理作用机制。2、实验方法2.1大鼠慢性萎缩性胃炎模型的制备及模型评价以去氧胆酸钠水溶液饮用配合酒精灌服,刺激大鼠诱发慢性萎缩性胃炎模型。动物模型复制期间,分别于第80、100天随机抽取大鼠进行胃组织病理学检查(HE染色),以大鼠胃粘膜病理改变程度,判断模型成功与否。2.2甘草总黄酮对胃黏膜损伤的保护作用慢性萎缩性胃炎模型大鼠进行随机分组后,分别连续灌胃甘草总黄酮(高、低剂量)；维酶素(阳性药物组)；蒸馏水(模型对照组)30天,以动物一般体征、胃组织病理学检查(HE染色、扫描电镜)、胃粘膜上皮细胞粘蛋白分泌功能、胃微循环血流量、胃肠激素分泌功能为评价指标,观察药物对胃黏膜的保护作用。2.3甘草总黄酮抑制胃粘膜萎缩机制研究试验周期结束后,处死大鼠,ELISA法测定血清中IL-1β、IL-6及PGE2含量等含量。胃组织用10%甲醛溶液固定并进行常规石蜡包埋,切片。采用免疫组化以及蛋白质印迹法检测慢性萎缩性胃炎模型大鼠胃黏膜Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。3、实验结果3.1慢性萎缩性胃炎大鼠模型的评价动物模型复制期间,分别于第80、100天随机抽取大鼠进行胃组织病理学检查(HE染色),观察动物的病理进程。通过HE染色观察结果显示,与正常对照组比较,CAG模型组大鼠胃粘膜充血、水肿、腺管排列紊乱或疏密不均且黏液层脱落增多、胃小凹变浅,同时粘膜固有层变薄,萎缩,粘膜肌层紊乱、增厚,呈束状增生侵蚀渗入粘膜固有层,腺体腔变小及数目减少,并有囊性扩张,粘膜下层水肿明显,炎性细胞散在分布,固有层内有淋巴细胞浸润等病变,说明在100天时模型复制成功。3.2甘草总黄酮对于大鼠慢性萎缩性胃炎胃黏膜保护作用3.2.1对体重恢复及一般生理状况的改善作用动物给药期间,无拒食现象,精神状态正常,无震颤、扭体、翘尾等现象发生,大鼠鼻、眼、口腔无异常分泌物,呼吸均匀,实验期间内无动物死亡。试验周期内,CAG模型组动物体重增长较正常对照组缓慢,与正常对照组比较差异显著。甘草总黄酮连续给药30d后,高、低剂量组体重增长均高于模型组。3.2.2抑制CAG模型大鼠胃黏膜腺体萎缩胃组织病理学结果显示(HE染色),与正常对照组比较,CAG模型组大鼠胃粘膜充血、水肿、腺管排列紊乱或疏密不均且黏液层脱落增多、胃小凹变浅,同时粘膜固有层变薄,萎缩,粘膜肌层紊乱、增厚,呈束状增生侵蚀渗入粘膜固有层,腺体腔变小及数目减少,并有囊性扩张,粘膜下层水肿明显,炎性细胞散在分布,固有层内有淋巴细胞浸润等病变。甘草总黄酮给药30天后,胃粘膜固有层炎性细胞数目减少,胃腺数目增多,腺管排列较整齐,胃黏液分泌增加,与模型对照组比较,甘草总黄酮高、低剂量组胃粘膜腺体萎缩率显著降低。病理等级评分结果显示,甘草总黄酮高、低剂量组胃组织病理变化等级评分降低,与模型对照组比较差异显著。扫描电镜结果表明,甘草总黄酮给药治疗30天后,高、低剂量组胃小凹面积显著减小,上皮细胞萎缩程度减轻,与模型对照组比较差异显著,并与给药剂量呈正相关。3.2.3对胃粘膜病理损伤的抑制及修复作用胃病理结果显示,萎缩性胃炎模型大鼠胃体部和幽门部粘膜固有层均变薄,而粘膜肌层厚度增厚,其中胃体部粘膜固有层和粘膜肌层增厚,与正常对照组比较差异显著。与模型对照组比较,安胃疡高、低剂量组胃粘膜固有层和粘膜肌层厚度恢复到接近正常水平,提示甘草总黄酮对损伤后的胃粘膜有显著的修复作用。AB-PAS染色结果表明,甘草总黄酮高、低剂量组酸性粘蛋白指数显著升高,低剂量组上皮细胞粘蛋白指数显著升高,黏膜屏障完整性恢复,提示甘草总黄酮有促进黏液分泌及维护黏膜屏障完整性作用。3.2.4显著改善CAG大鼠胃分泌功能实验结果表明,CAG模型对照组胃液分泌量与正常对照组比较减少,甘草总黄酮高、低剂量组胃液分泌量有所增加,其中高剂量组较模型组比较具有统计学意义。胃液pH值测定结果显示,甘草总黄酮高、低剂量组胃液PH值升高,与模型对照组比较具有统计学意义。同时甘草总黄酮高、低剂量组胃蛋白酶活性显著升高。3.2.5改善CAG大鼠胃微循环血流量实验结果表明,CAG模型组大鼠胃微循环血流量显著下降,与正常对照组比较差异显著。甘草总黄酮给药30天后胃体部、幽门部血流量值增加,与模型对照组比较甘草总黄酮高、低剂量组胃微循环均有较大程度的改善。3.3甘草总黄酮对于CAG大鼠胃黏膜保护作用药理机制3.3.1甘草总黄酮调节慢性萎缩性胃炎炎性因子的分泌实验结果表明,慢性萎缩性胃炎模型组血清IL-1β、IL-6水平显著高于正常对照组,而PGE2水平显著降低。甘草总黄酮连续灌胃30天后,高、低剂量组显著降低浅表性胃炎大鼠血清IL-1β、IL-6水平；同时PGE2水平升高。3.3.2甘草总黄酮对胃黏膜上皮细胞凋亡信号通路的影响通过免疫组化以及蛋白质印迹法的结果显示,模型组大鼠胃黏膜Bcl-2表达量相比正常对照组显著升高,而Bax表达量则显著下降；甘草总黄酮给药30d后,Bcl-2蛋白的表达量较模型组显著下降,同时又能显著上调Bax蛋白的表达。4、研究结论4.1甘草总黄酮能够抑制胃黏膜固有腺体的萎缩。减少胃粘膜固有层损伤,对损伤的胃粘膜具有保护和修复作用。4.2甘草总黄酮能够改善胃肠激素的分泌；增加胃微循环血流量,改善胃微循环状况,促进胃黏膜上皮细胞的自我修复。4.3甘草总黄酮通过促进上皮细胞分泌粘蛋白及酸性粘蛋白,从而保护和修复胃粘膜上皮细胞。4.4甘草总黄酮通过调控Bc1-2和Bax蛋白的表达,促进胃黏膜上皮细胞的正常凋亡,从而修复胃黏膜的萎缩。