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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国传统药材,在预防和治疗心脑血管疾病等方面疗效显著使得丹参药材紧缺,市场上供不应求。丹参的药效成分主要是丹参酮类和丹酚酸类化合物,解析其活性成分的代谢调控网络,对提升丹参药材品质具有重要的理论指导意义。转录因子在调控植物次生代谢方面扮演着重要角色,本研究以丹参为试验材料,重点分析了一个在根部高丰度表达的转录因子SmbHLH74调控丹参酮生物合成的功能,丹参毛状根中过量表达SmbHLH74可以显著抑制丹参酮的积累,利用凝胶迁移阻滞、染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶报告基因检测等试验,解析了转录因子SmbHLH74抑制丹参酮生物合成的分子机制;另外发现SmMYC2是SmbHLH74的直接上游调控分子,进而探讨了JA通过SmMYC2削弱SmbHLH74抑制丹参酮积累的分子机制。主要结果如下:1.从丹参中克隆了SmbHLH74基因,CDS为696 bp,编码231个氨基酸。2.SmbHLH74在根中高水平表达,茎和叶片中的表达水平很低;外源MeJA处理可以显著抑制SmbHLH74的转录。3.通过遗传转化获得过表达SmbHLH74的丹参转基因毛状根,在SmbHLH74-OE4、SmbHLH74-OE12和SmbHLH74-OE19过表达毛状根株系中隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量显著降低;利用RT-qPCR分析了转基因材料中丹参酮生物合成途径基因的表达水平,SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的表达量呈显著下调,推测这三个基因可能是SmbHLH74的直接靶基因。4.为解析SmbHLH74抑制丹参酮积累的分子机制,利用ChIP-qPCR和EMSA试验证实了SmbHLH74转录因子在丹参体内和体外直接结合SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的启动子;进一步双荧光素酶报告基因检测试验表明SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1启动子的转录活性。5.JA显著抑制SmbHLH74的转录,推测JA信号关键转录因子SmMYC2可能是SmbHLH74的上游分子,通过Y1H和EMSA试验发现SmMYC2可以结合SmbHLH74的启动子;GUS报告试验表明SmMYC2直接负调控SmbHLH74的转录,说明SmMYC2直接介导了JA对SmbHLH74的转录抑制。综上,本研究揭示了SmbHLH74直接抑制SmHMGR1、SmGGPPS1和SmCYP76AH1的转录从而负调控丹参酮生物合成,而JA通过SmMYC2直接抑制SmbHLH74的转录,削弱了SmbHLH74对丹参酮积累的抑制。