土壤中过多的盐分是影响植物正常发育生长的非生物胁迫性因素之一。土壤中过多的Na~+对植物的胁迫作用主要表现在水分亏缺、Ka~+/Na~+比率的改变及Na~+、Cl~-浓度改变造成的离子胁迫,从而造成植株体内离子内稳态平衡破坏、代谢紊乱,并由此导致植株的生长和发育受到影响。植物耐盐的机制主要包括渗透调节和降低胞质内Na~+水平。降低Na~+的吸收、外排Na~+和区隔化Na~+是植物保持胞质内低Na~+浓度的策略。其中的Na~+的外排和区隔化是间接的主动运输过程,主要由Na~+/H~+逆向转运蛋白来调节。Na~+/H~+逆向转运蛋白是细菌、藻类、动物和高等植物膜系统上普遍存在的一种转运蛋白,参与细胞内的Na~+浓度、pH调节及细胞体积变化等生命活动,其在细胞质膜和液泡膜上均有分布。液泡膜上的Na~+/H~+逆向转运蛋白将胞质中的Na~+逆Na~+浓度梯度运送到液泡中进而将Na~+区隔化集中。Na~+的区隔化还可降低细胞水势,抵抗盐分造成的渗透胁迫。自液泡型Na~+/H~+逆向转运蛋白编码基因首次从拟南芥中克隆出来后,对于该基因的研究日趋深入,大量实验结果表明,向植物转入Na~+/H~+逆向转运蛋白基因可以显著提高植物的耐盐性。菊花原产我国,是四大名花之一,有些品种还具有一定的药用价值。虽然有个别菊花对盐胁迫有一定的耐受,但大部分观赏价值高的菊花对盐渍和干旱胁迫敏感。若想在更广大区域,特别是盐碱地较多的地区大面积种植,还需要培育耐盐能力更强的菊花新品种。因此需要对其耐盐性状进行研究,从而更好地利用基因工程的手段对其进行改造。目前,对于菊花中克隆耐盐性有关基因的研究尚处于起步阶段,鲜有研究报道。因此,鉴定出与菊花耐盐性相关的主效基因特别是Na~+/H~+逆向转运蛋白基因就显得非常重要和迫切。本研究通过同源序列设计简并引物,利用RT-PCR及RACE技术,首次从菊花中克隆出Na~+/H~+逆向转运蛋白编码基因DmNHX1。序列分析表明,DmNHX1全长1897bp,包括18bp的5′非翻译区,202bp的3′非翻译区和1653bp的开放阅读框。此cDNA可编码含550个氨基酸的多肽,推测分子量为61.1KDa,含有Na~+/H~+逆向转运蛋白高度保守序列LFFIYLLPPI。经过同源序列比较及进化关系分析,推断DmNHX1的编码产物为液泡型Na~+/H~+逆向转运蛋白,与拟南芥、水稻液泡型Na~+/H~+逆向转运蛋白的同源性分别达73%和76%。疏水性分析表明,该基因编码的多肽链有12个跨膜结构域,为此类蛋白的典型结构。利用酵母互补实验验证该基因的功能,将DmNHX1转入盐敏感的酵母突变株(Δnhx1)使得菌株分别可以在含有400mM的NaCl、1M KCl、100mM LiCl和HYG(50μg/mL)的培养基中部分恢复生长,证明该基因有一定的耐盐功能。将菊花植株经150mM NaCl盐溶液处理13天后,利用荧光定量PCR和原子吸收光谱测定分析盐处理前后DmNHX1在mRNA水平上表达变化及组织特异性、Na~+含量的变化及组织分布。荧光定量PCR的结果显示,盐处理后DmNHX1在根、茎、叶和花四个部位的表达均有上调,分别为对照组的2.04、1.13、3.53和1.17倍。原子吸收光谱测定Na~+对照组在根、茎、叶和花四个部分的含量分别为0.76%、1.00%、1.10%和1.40%,盐处理后的实验组四个部位的Na~+含量分别为1.30%、1.40%、3.20%和1.40%。荧光定量PCR与Na~+含量测定的结果表明,盐胁迫使得DmNHX1表达量增加,进而区隔化更多的Na~+于液泡中,导致Na~+含量的增加。各个部位增加的程度不同揭示了DmNHX1表达的较为显著的组织器官特异性的特征。其中花器官中DmNHX1在盐胁迫后表达水平微增,Na~+含量也几乎没有变化,说明DmNHX1在花中的表达有着一定的特殊性。