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为了研究鞭毛蛋白在松萎蔫病中的具体作用,本文首先对松材线虫携带的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)分泌的鞭毛蛋白对黑松愈伤组织细胞的致死方式进行研究。结果表明,经过鞭毛蛋白处理的黑松愈伤组织细胞细胞核解体、基因组DNA发生降解,但无明显的梯形条带形成,因此推测鞭毛蛋白对黑松细胞的处死方式为非典型性细胞凋亡。其次,本文还研究了鞭毛蛋白诱导的黑松细胞死亡对松材线虫及其携带的荧光假单胞菌GcM5-1A的繁殖影响,结果表明,鞭毛蛋白预处理黑松愈伤组织细胞再接种松材线虫较正常的愈伤组织细胞能促进松材线虫的繁殖,且在0～9 d范围内,处理时间越长则松材线虫的繁殖速度越快；同时,鞭毛蛋白预处理的黑松愈伤组织细胞较正常的愈伤组织对松材线虫携带荧光假单胞菌的繁殖也有一定的促进作用,用加热致死黑松愈伤组织分别接种松材线虫及其携带的荧光假单胞菌获得了相似的结果；将松材线虫直接接种于鞭毛蛋白溶液并培养5 d,结果发现接入松材线虫的鞭毛蛋白较对照组明显减少,条带无降解的现象,并且松材线虫的数量有明显的增加,推测可能是松材线虫因摄食了鞭毛蛋白而促进其繁殖。上述研究表明,鞭毛蛋白不仅通过诱导黑松细胞的死亡对松材线虫及其携带致病荧光假单胞菌的繁殖具有一定的促进作用,而且鞭毛蛋白本身可以提供松材线虫繁殖的营养而促进松材线虫的繁殖,这为松萎蔫病的松材线虫与细菌复合致病学说提供了进一步的实验证据。为了进一步研究鞭毛蛋白的作用机理,本文还开展了荧光假单胞菌GcM5-1A (P. fluorescens GcM5-1A)鞭毛蛋白基因的克隆与重组表达的研究,结果表明,荧光假单胞菌GcM5-1A鞭毛蛋白基因的开放读框全长1659 bp,共编码552氨基酸残基。荧光假单胞菌GcM5-1A (P. fluorescens GcM5-lA)鞭毛蛋白基因经PCR扩增后克隆到表达载体pET-15b上,构建表达载体pET-15b-fla。将pET-15b-fla转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导重组鞭毛蛋白在工程菌中的高效表达,通过亲和层析对重组鞭毛蛋白初步纯化。细胞免疫荧光分析表明,鞭毛蛋白与黑松细胞存在直接相互作用,我们怀疑在黑松细胞膜上可能存在鞭毛蛋白的受体蛋白,从而引起细胞凋亡,为此,本文还探讨了黑松细胞膜蛋白的提取方法,为分离鉴定黑松细胞膜上可能存在的鞭毛蛋白受体打下基础。