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随着黄姑鱼（Nibea albiflora）养殖业的快速发展和养殖规模的不断扩大,其病害问题逐渐显现,其中由弧菌属细菌感染的病害尤为严重,造成养殖黄姑鱼大规模死亡,成为影响该品种养殖健康持续发展的关键因素,同时造成了严重的经济损失。因此,阐明黄姑鱼的免疫生物学特征和抗病机制尤为重要。Toll样受体家族（Toll-like receptor family）介导的先天性免疫是鱼类抗病免疫的第一道防线,在先天免疫和获得性免疫反应之间起着桥梁作用。TLR13作为TLR家族中的成员之一,参与机体的免疫和炎症反应。因此,本研究立足于黄姑鱼养殖过程中受到病原菌威胁的现状,获得了黄姑鱼TLR13（命名为NaTLR13,Gen Bank登录号:MT701899）c DNA全长序列;检测了NaTLR13和髓样分化因子（命名为NaMyD88,Gen Bank登录号:MN384261.1,前期实验获得）在受副溶血弧菌、溶藻弧菌、Poly（I:C）感染的黄姑鱼中的表达量变化;构建真核表达载体探究两个分子细胞定位及其共定位情况;对NaTLR13-LRR和NaTLR13-TIR进行原核表达,并对其诱导条件进行优化,纯化重组蛋白,检测分析了NaTLR13-LRR和NaTLR13-TIR蛋白的菌结合活性。从以上实验中初步探索了NaTLR13介导机体抗病原体感染的分子机制。取得的主要研究结果如下:1、NaTLR13的获取及序列分析。基于黄姑鱼转录组数据,使用同源克隆和RACE技术获得了NaTLR13的c DNA全长序列为4210 bp,开放阅读框（ORF）为2886 bp,编码962个氨基酸残基,分子量为110.37 k Da,理论等电点（p I）为9.08。包含15个富亮氨酸重复序列（LRRs）、一个Toll-IL-1受体结构域（TIR）、一个LRR-CT末端结构域、两个LRR-TYP结构域和两个跨膜结构域。多序列比对和系统发育分析结果表明,黄姑鱼TLR13与大黄鱼和棘头梅童鱼具有较高的相似性（分别为88.79%和87.02%）,并位于同一进化树分支,推测其在免疫应答上也具有相似性。2、NaTLR13和NaMyD88时空表达分析。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）结果显示,NaTLR13和NaMyD88的m RNA在所有被检组织中均有表达,NaTLR13在脾脏中表达最高,其次是肝脏、肾脏、鳃、心脏、肠和肌肉,胃最低（P＜0.05）;NaMyD88也在脾脏表达量最高,其次是肝脏、肾、鳃、肠、胃、肌肉,心脏表达最低（P＜0.05）。经溶藻弧菌、副溶血性弧菌、Poly（I:C）分别感染后,脾脏组织内NaTLR13的表达水平随时间先升高后降低,最终趋于稳定。NaTLR13分别在不同菌感染后的24 h、12 h和12 h表达量达到最高（P＜0.05）;PBS作为对照组注射后的表达量维持在一个相对稳定的水平,溶藻弧菌感染组最高表达明显高于副溶血性弧菌和Poly（I:C）两组。NaMyD88在溶藻弧菌、副溶血性弧菌、Poly（I:C）刺激后均出现了明显的表达上调,在12 h表达量达到最高值（P＜0.05）,并随着时间的增长表达量呈先增后减的趋势。上述结果表明NaTLR13与NaMyD88可能在黄姑鱼应对感染刺激产生免疫应答时发挥重要作用。3、NaTLR13-LRR和NaTLR13-TIR重组蛋白的体外诱导表达、纯化及抗菌结合。构建NaTLR13重要功能域LRR和TIR的重组蛋白原核表达系统,获得的NaTLR13-LRR和NaTLR13-TIR蛋白分子量分别为81.69 k Da和47.58 k Da;优化诱导表达条件,得到最适表达温度为37℃,IPTG浓度为0.5 mmol/L,培养4 h可获得最大诱导量;超声破碎后SDS-PAGE检测目的蛋白存在于上清;使用Ni-NAT Superflow树脂试剂盒纯化,将纯化蛋白分别与溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌共同孵育进行体外结合实验,蛋白免疫印迹（Western blot）结果显示NaTLR13-TIR和NaTLR13-LRR重组蛋白能分别与弧菌属细菌进行结合,说明NaTLR13具备识别细菌的能力。4、NaTLR13与NaMyD88的亚细胞定位及共表达分析。分别构建黄姑鱼p EGFP-NaTLR13和p Ds RED-NaMyD88融合表达载体,检测发现NaTLR13-EGFP在细胞质内以不均一的点状信号分布,NaMyD88-Ds RED在细胞质中均匀分布,两者共表达位置一致,表现为在细胞质以不均一的点状信号分布。根据结果推测,NaMyD88与NaTLR13之间可能存在相互作用关系。本研究初步探索了NaTLR13作为受体参与黄姑鱼识别病原菌、介导机体天然免疫的生物学功能,证明黄姑鱼机体中可能存在依赖MyD88分子的TLR-NF-κB天然免疫信号通路,在抗菌感染中发挥着重要的作用,因此,本实验结果将为今后从蛋白水平研究天然免疫分子的功能机制提供借鉴,同时,也为揭示黄姑鱼等海洋鱼类健康养殖提供理论指导。