目的:　　 临床上经常遇到因先天性疾病、炎症、肿瘤、或其它因素引起的广泛气管病变而需要进行节段切除和气管重建。疾病导致气管节段切除后端端吻合的安全长度为成人1/2、小儿1/3的气管长度。超过此长度时,如何修复缺损气管是国内外胸外科的热点和难点问题。关于气管替代物的研究有许多尝试,包括同种异体气管、非气管的自体组织(如小肠)和人工气管假体(如金属支架)等。近年来组织工程化气管的研究,包括支架(生物材料)和种子细胞的选择、移植物再血管化和上皮再生等方面取得了一些进展。但是,由于气管的特殊的生理特点和功能需要,目前仍未找到理想的组织工程化气管,因而同种异体气管仍然是临床上的首选。对于供体气管的储存,移植后的免疫排斥反应的抑制,移植气管的上皮再生和再血管化是临床应用前亟待解决的难题。　　 本博士论文的设计旨在解决以上的难题,对如何储存供体气管,降低异体气管的免疫原性,促进移植气管的上皮再生和再血管化进行了研究。我们应用静脉移植骨髓间充质干细胞合并深低温处理供体气管进行同种异体气管移植,探讨深低温处理对于减轻移植后的免疫排斥反应和骨髓间充质干细胞在促进移植气管上皮和新生血管生成中的作用,为将来的临床应用提供实验依据。　　 材料和方法:　　 一、大鼠深低温同种异体气管移植动物模型的建立及冻储2 wk和6 wk气管移植的比较　　 (一)实验材料　　 1、实验动物　　 清洁级Wistar大鼠,体重280～300 g,分别作为大鼠同种异体气管移植的供体和受体。　　 2、主要试剂　　 冷冻保护剂(DMEM培养基,胎牛血清,二甲基亚砜,蔗糖,青霉素,链霉素,二性霉素B),水合氯醛　　 3、主要仪器　　 超净工作台;液氮罐;手术器械;光学显微镜;电子显微镜。　　 (二)实验动物和分组　　 雌性Wistar大鼠,由中国医科大学实验动物部提供。作为气管移植供体的大鼠14只,每只大鼠可提供2个8～10个气管环的供体气管。作为气管移植受体的大鼠40只,随机编号分为4组,即分别移植深低温2 wk和6 wk气管的实验组(cryopreserved allograft,ALLO-2wk and ALLO-6wk),以及新鲜自体气管移植(fresh autograft,AUTO-control)和新鲜(未经深低温处理)异体气管移植(freshallograft,ALLO-control)的对照组。各组实验动物拟于移植后的第1、4和8周各处死4只。但新鲜异体气管移植的大鼠(N=4)均在3天内死亡,ALLO-2wk大鼠(N=12)均在10天内死亡。　　 (三)实验方法　　 1、预先取供体气管8～10个气管环置入装有冷冻保护剂的冻存管中,4℃冷平衡4 hr后置入-80℃24 hr,取出后投入液氮中储存至2 wk和6 wk。　　 2、受体大鼠麻醉后,切除颈段2～3个气管环,将复温后的供体气管经末端修剪后剩余6～8个气管环,以端端吻合方式与受体大鼠的断端气管吻合,并用颈部肌肉包裹吻合部位,建立同种异体气管移植动物模型。　　 3、观察指标及检测方法　　 (1)观察术后受体存活时间。　　 (2)光镜和电镜观察移植物吻合口附近气管生长和再生情况。　　 二、大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及标记　　 (一)实验材料　　 1、实验动物　　 清洁级Wistar大鼠,4-5周龄,体重60～80g,BMSCs培养原代取材使用。　　 2、主要试剂　　 DMEM低糖培养基,成骨诱导培养液;成脂肪诱导培养液;茜草素红;油红0;　　 3、主要仪器　　 超净工作台;二氧化碳培养箱;倒置显微镜;低温离心机。　　 (二)实验方法　　 1、贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs。　　 2、体外诱导方法鉴定BMSCs分化能力。　　 3、测定BMSCs生长曲线,评估BMSCs体外生长能力。　　 4、应用成脂肪和成骨诱导进行BMSC的鉴定。　　 5、当细胞传到3～5代时,收集离心冲洗,并用PKH-26荧光进行细胞标记。　　 6、观察指标及检测方法　　 (1)在倒置显微镜下观察BMSCs的细胞生长情况。　　 (2)在倒置荧光显微镜下观察BMSCs的荧光标记情况　　 三、骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储对大鼠同种异体气管移植上皮再生和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响　　 (一)实验材料　　 1、实验动物　　 清洁级Wistar大鼠,体重280～300g,分别作为大鼠同种异体气管移植的供体和受体;另取4～5周龄,体重60～80g,BMSCs培养原代取材使用。　　 2、主要试剂　　 DMEM低糖培养基,冷冻保护剂,抗VEGF抗体　　 3、主要仪器　　 超净工作台;二氧化碳培养箱;倒置显微镜;低温离心机;液氮罐;手术器械;电子显微镜。　　 (二)实验动物和分组　　 雌性Wistar大鼠72只,由中国医科大学实验动物部提供。作为气管移植供体的大鼠24只,每只大鼠可提供2个8～10个气管环的供体气管。作为气管移植受体的大鼠48只,随机分为4组,给予异体深低温冻储2 wk和6 wk的气管移植后,通过鼠尾静脉注射BMSCs的实验组(BMSC-2wk;BMSC-6wk)和注射PBS的对照组(PBS-2wk;PBS-6wk),各组实验动物分别拟于移植后的第1、4和8周各处死4只。　　 (三)实验方法　　 用深低温冻储2 wk和6 wk的气管进行同种异体气管的移植后,用PKH-26标记后的3～5代BMSCs经鼠尾静脉移植入受体内,用等量的PBS注射作为实验对照。观察供体气管的组织学,上皮爬行和新生血管情况;局部PKH-26荧光检测和VEGF蛋白水平来评价BMSC对移植气管的新生上皮和新生血管作用的效果。　　 实验结果:　　 一、大鼠深低温同种异体气管移植动物模型的建立及冻储2 wk和6 wk气管移植的比较　　 新鲜自体气管移植(对照,AUTO-control)组的气管术后1、4和8wk观察结果:移植气管结构完整,管腔内为假复层纤毛柱状上皮所覆盖,软骨无变性坏死;术后能长期存活。新鲜异体气管移植(对照,ALLO-control)组的大鼠均于术后3天内因气管管腔塌陷,移植气管坏死而死亡。深低温冻储2周(ALLO-2wk)组的大鼠均于术后10天内死亡。其中4只于1wk时按实验设计处死,其余8只分别于术后5d(N=1)、6d(N=2)、8d(N=3)和10d(N=2)时因气管管腔塌陷,移植气管坏死而死亡。显微镜下见移植气管内有大量淋巴细胞和单核细胞的浸润。深低温冻储6周(ALLO-6wk)组的大鼠的移植气管上皮形态上与自体气管移植组相比,其复层上皮厚度明显变薄或成单层,但未见有单核细胞浸润,可长期存活。其中有8只分别于术后1wk(N=4)和4wk(N=4)时按实验设计处死,其余4只分别于术后14d(N=1)、18d(N=1)、30d(N=1)和35d(N=1)时因肉芽增生,气管管腔狭窄而死亡。　　 二、大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、鉴定及标记　　 1、倒置显微镜下观察到体外培养的原代BMSCs48 hr内可见有少量贴壁细胞,贴壁的BMSC细胞呈圆形,成纤维细胞样或纺锤体样,12 d后能够达到90％融合;荧光显微镜下见几乎所有BMSCs均已被标记红色荧光。　　 2、用茜草素红和油红0分别对向成骨细胞和脂肪细胞诱导的BMSCs进行染色发现各自向诱导的细胞分化,光镜下观察有红色的骨基质的沉积和脂滴形成。　　 三、骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储对大鼠同种异体气管移植上皮再生和VEGF表达的影响　　 1、骨髓间充质干细胞移植合并深低温冻储后的移植气管结构完整,组织学检查管腔内为假复层纤毛柱状上皮所覆盖,软骨无变性坏死;术后均能长期存活。PBS对照组中,深低温6 wk的移植气管(PBS-6wk)上皮再生情况优于2 wk(PBS-2wk),PBS-6wk实验大鼠最长存活35d,PBS-2wk实验大鼠最长存活10d;骨髓间充质干细胞移植组中,BMSC-6wk实验大鼠能存活到8wk(12只大鼠分别按实验设计在1wk、4wk、8wk时处死),BMSC-2wk实验大鼠中有一例能存活到8wk(8只大鼠分别按实验设计在1wk和4wk时处死,1只在8wk按实验设计处死),其余3只分别于30,32和42d时死亡。移植物上皮再生情况无明显差别。　　 2、PKH-26标记的BMSCs在气管组织定植后呈现红色荧光。术后1wk即可见受体气管吻合口处组织有红色荧光标记,术后4wk和8wk仍可见受体气管和移植气管处有红色荧光标记,其中以吻合口处荧光标记较多。各时间段远离吻合口的受体气管基本未见红色荧光标记物。表明BMSCs经静脉移植后,可向损伤的气管组织迁移并定位,而且可随移植气管的血管化逐渐由受体气管切缘向移植气管迁移,最后可定位于移植段气管。　　 3、免疫组织化学结果发现VEGF蛋白在气管上皮内有阳性表达,术后1wk的气管标本中,BMSCs移植组的上皮细胞表达VEGF水平高于PBS对照组。骨髓间充质干细胞移植组术后1wk、4wk和8wk的气管标本中,BMSC-2wk和BMSC-6wk的移植气管VEGF水平无明显差别。　　 结论:　　 1、移植经深低温冷冻的异体气管的大鼠存活时间明显长于新鲜异体气管移植组。其中,ALLO-6wk组的大鼠存活时间,移植气管的上皮再生情况要优于ALLO-2wk,表明深低温冷冻6wk后的气管,其免疫原性低于深低温冷冻2wk的气管。　　 2、经静脉注射移植BMSCs后,受体大鼠的存活时间,移植气管的上皮再生情况要优于PBS注射的对照组。　　 3、气管移植处聚集的红色PKH-26荧光表明尾静脉注射的BMSCs可经血液循环迁移到受损的组织处并发挥修复作用。移植物内VEGF蛋白的高水平表明BMSCs可能促进移植物周围的新生血管的增加,从而促进气管的损伤恢复。另外,BMSCs也可能通过抑制免疫排斥反应来促进移植气管的上皮再生和功能恢复。