[背景]帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中老年人常见的中枢神经系统慢性退行性疾病。以静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓、姿势步态异常及植物神经功能紊乱为主要临床表现,严重影响患者的生活质量,与痴呆、中风一起被称为老年人致残的三大疾病。其发病率随着年龄的增长逐年升高,伴随着社会老龄化的到来,患病人数逐年增多,我国目前PD患者已超过200万。其致残率高,治愈率低,年治疗费逾万元,给病人身心造成极大痛苦的同时,也给家庭及社会带来沉重的经济负担。由于PD的发病十分复杂,其发病机制目前尚不明确,治疗上尚无延缓疾病进程的有效疗法。由于PD是由脑内多巴胺含量下降导致的,综览国内外有关治疗PD的研究,西药的替代疗法在PD的治疗中仍占主导地位。西药治疗PD的优势在于针对性强,能够明显改善临床症状,西药美多芭更被誉为治疗本病的“金药物”。但其不足之处是随着用药时间延长出现疗效衰减,不良反应较多,并且出现异动症、“开关”现象及精神症状等并发症,许多患者不能耐受而被迫停药。而手术治疗虽对肢体震颤和肌肉强直有很好的疗效,但对姿势步态异常和平衡障碍无明显改善,且手术治疗仅是改善症状,不能根治疾病,术后仍需继续服药,并非治疗的首选方案。近年来,随着对干细胞移植及基因疗法的不断深入研究,虽然在治疗PD方面也显示出了良好前景,但此项技术仍需进一步成熟,同时高昂的费用也制约了其在临床的推广应用。祖国医学对PD的治疗可追溯到内经时期,经过数千年的经验积累,中医药在PD的治疗中也显示出了不可替代的作用。近年来,通过将传统中医基础理论和现代先进医学技术相结合的方法,对中药单体、复方的药效和作用机制,针灸及针药结合的临床疗效都进行了深入的研究,也取得了令人满意的成果。中医药在改善患者的临床症状,尤其是对非运动症状的改善,能够提高患者的生活质量,具有显著的治疗优势。因此,为了提高中医药治疗PD的临床疗效,进一步探讨其作用机理,寻求有效的疗法,具有重要的理论和现实意义,也是当今医学领域研究的重要课题之一。[目的]通过建立PD大鼠模型,观察造模前后实验大鼠行为学的变化,并检测各组大鼠脑组织形态学的变化,泛素-蛋白酶体通路相关蛋白表达量的变化及细胞凋亡的情况,探讨熄风定颤丸通过调控蛋白降解通路保护PD模型大鼠多巴胺神经元细胞的作用机制,为中医药治疗PD提供依据。[方法]本实验选用SPF级雄性SD大鼠,采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)单侧双点注射法制备PD动物模型。将造模成功的大鼠随机分为熄风定颤丸高、中、低剂量组,美多芭组,模型组,并设假手术对照组,然后给予对应的药物灌胃治疗8周。实验共分为三个部分进行检测:实验一:经阿扑吗啡(Apo)诱导后,观察各组大鼠行为学表现,并计算30min内实验大鼠旋转总圈数。通过免疫组化方法观察实验大鼠脑组织黑质络氨酸羟化酶(TH)免疫阳性细胞的表达,以检测多巴胺神经元细胞损毁情况。探讨熄风定颤丸对PD模型大鼠旋转行为的影响及对神经元细胞的保护作用。实验二:采用免疫组化方法观察各组大鼠脑组织Bcl-2、Bax及Caspase-3免疫阳性细胞表达,并通过TUNEL方法检测各组大鼠脑组织细胞凋亡的情况,探讨熄风定颤丸对PD模型大鼠细胞凋亡的影响。实验三:采用Western Blot方法检测各组实验大鼠脑组织内泛素-蛋白酶体通路中的泛素蛋白(UB)、泛素激活酶E1(UBE1)、Parkin蛋白、泛素羧基端水解酶-L1(UCH-L1)及α-突触核蛋白(α-Synuclein)含量的表达,探讨熄风定颤丸对PD模型大鼠泛素-蛋白酶体通路的影响。[结果]1行为学检测结果显示:假手术组大鼠治疗前、后未出现向健侧旋转行为,而造模术后的大鼠出现以健侧后肢为支点向健侧恒向旋转的行为,且旋转速度较快,均超过210r/30min。与模型组相比,美多芭组与熄风定颤丸高、中、低剂量组在治疗前旋转速度差异无统计学意义(P>0.05)。经过灌胃治疗后,美多芭组与熄风定颤丸高、中、低剂量组大鼠旋转速度明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),且随着时间的延长下降越明显。2脑组织形态学的观察通过中脑黑质区TH免疫组化显示,假手术对照组大鼠中脑黑质区可见大量TH免疫阳性细胞,呈圆形或椭圆形,且形态饱满,胞浆内棕色颗粒物质浓密。与假手术对照组相比,模型组大鼠中脑黑质区TH免疫阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),且细胞形态不完整,大多呈破碎状,染色不均匀,部分视野可见大量增生的胶质细胞。与模型组相比,熄风定颤丸高、中、低剂量组及美多芭组TH免疫阳性神经细胞数明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。3神经元细胞凋亡的观察免疫组化结果显示,假手术对照组大鼠中脑黑质区可见大量Bcl-2阳性细胞和少量的Bax和Caspase-3阳性细胞。与假手术对照组相比,模型组大鼠中脑黑质区Bcl-2阳性细胞明显减少,而Bax和Caspase-3阳性细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。而与模型组相比,美多芭组及熄风定颤丸高、中、低剂量组大鼠脑黑质区Bcl-2阳性神经细胞数明显增多,Bax和Caspase-3阳性细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL检测结果显示,假手术对照组大鼠中脑黑质区凋亡细胞较少。与假手术对照组相比,模型组大鼠中脑黑质区出现大量凋亡细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,美多芭组及熄风定颤丸高、中、低剂量组大鼠脑黑质区凋亡细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4 UPP通路相关蛋白表达量的观察结果显示,与假手术对照组相比,模型组大鼠脑组织中UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白表达量明显下降,而α-Synuclein蛋白表达量明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,美多芭组及熄风定颤丸各组大鼠脑组织中UB、UBE1、Parkin和UCH-L1蛋白表达量明显增高,而α-Synuclein蛋白表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]具有滋补肝肾、熄风止颤作用的中药熄风定颤丸,能够修复6-OHDA对实验大鼠脑组织黑质神经元细胞造成的损伤,对实验大鼠的异常行为具有很好地改善作用,同时能够通过调控UPP功能促进其对异常蛋白的降解,拮抗黑质神经元细胞凋亡,对多巴胺能神经元细胞具有很好地保护作用。